陳濤 周琳 周杰 李海成 江勇 彭東東 周志剛 彭建明 文力何超文 錢明 孫毅凡 石磊 鐘球

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法快速檢測結(jié)核分枝桿菌的臨床應(yīng)用評估

陳濤 周琳 周杰 李海成 江勇 彭東東 周志剛 彭建明 文力何超文 錢明 孫毅凡 石磊 鐘球

目的進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法（LAMP法）快速檢測結(jié)核分枝桿菌的臨床驗證與應(yīng)用，評估該方法在結(jié)核病臨床診斷中的效能>。方法選取廣東6地市專業(yè)結(jié)核病防治機構(gòu)（簡稱“結(jié)防機構(gòu)”）的肺部不同疾病及健康人員的痰標本2129份，分別采用直接涂片法、羅氏固體培養(yǎng)法及LAMP法檢測痰標本中結(jié)核分枝桿菌；另廣州、汕頭兩市337例結(jié)核病患者的痰標本濃縮處理后進行實時熒光定量（qPCR）及LAMP兩種方法檢測>。結(jié)果2129例痰標本中，直接涂片法、羅氏固體培養(yǎng)法和LAMP法的陽性檢出率分別為13.2%（282／2129）、21.7%（463／2129）和20.3%（432／2129）；同羅氏培養(yǎng)法相比，LAMP法靈敏度、特異度、陽性和陰性預(yù)測值分別為89.1%（432／485）、95.5%（1570／1644）、85.4%（432／506）和96.7%（1570／1623）；337例濃縮處理后的痰標本qPCR陽性率為35.0%（118／337），LAMP陽性率為35.9% （121／337）；LAMP法同直接涂片法檢測、羅氏固體培養(yǎng)法和qPCR法比較，檢測結(jié)果實際一致率分別為87.9%（Kappa值＝0.612）、96.1%（Kappa值＝0.89）和91.4%（Kappa值＝0.812）>。結(jié)論LAMP法用于痰標本中結(jié)核分枝桿菌檢測，其效能同羅氏培養(yǎng)法及qPCR法相當，同直接涂片法相比，LAMP法能夠大幅提高陽性檢出率，具有很好的臨床應(yīng)用和推廣前景。

分枝桿菌，結(jié)核； 核酸擴增技術(shù)

結(jié)核病是全球衛(wèi)生的主要挑戰(zhàn)之一。根據(jù)最新的《世界衛(wèi)生組織全球結(jié)核控制報告》，2009年約有940萬結(jié)核病新發(fā)病例，170萬人因結(jié)核病而死亡。目前我國結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬，占全球發(fā)病的14.3%，位居全球第二位。

然而，與嚴峻的結(jié)核病形勢相比，結(jié)核病臨床診斷能力一直不如人意。目前的檢測方法主要有痰涂片直接鏡檢法、培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)法（如常規(guī)PCR、實時熒光PCR［1－3］、DNA 圖譜［4］等）。其中最主要的方法還是痰涂片直接鏡檢法和培養(yǎng)法，但其低檢出率及長檢測周期直接制約了其檢測效能；血清學(xué)方法特異度差；傳統(tǒng)PCR技術(shù)對于操作人員的技術(shù)要求及昂貴的儀器及耗材等直接制約了其推廣。因此，研究和開發(fā)新的快速、簡便、經(jīng)濟及有效的診斷技術(shù)成為目前結(jié)核病實驗室研究的一大熱點。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是Notomi等［5］于2000年發(fā)明的一種全新的核酸擴增方法，該法具有PCR技術(shù)的全部優(yōu)點，且使用高效的DNA聚合酶和2對引物，識別靶基因的6個不同區(qū)域，進一步縮短了檢測時間，增強了反應(yīng)的特異度。該技術(shù)無需昂貴的核酸擴增儀和檢測設(shè)備，在等溫條件（60～65℃）下完成反應(yīng)，擴增產(chǎn)物可以肉眼直接觀察，因此成本大大降低［5－9］，更利于基層單位推廣應(yīng)用。

本研究對筆者成功建立并開發(fā)的結(jié)核分枝桿菌LAMP快速檢測反應(yīng)體系進行優(yōu)化和企業(yè)小批量的生產(chǎn)，并且將生產(chǎn)的試劑盒在廣東省6家臨床醫(yī)療單位的檢驗科進行現(xiàn)場驗證檢測，共檢測2129例不同肺部疾病患者及健康人的痰標本。LAMP檢測結(jié)果與直接涂片抗酸染色法、羅氏固體培養(yǎng)法比較；另外，選取其中部分樣本采用中山大學(xué)達安基因公司的MTB qPCR試劑盒檢測進行比較、驗證。

材料和方法

一、研究對象與標本

2129例（名）研究對象與標本來自廣東省結(jié)核病防治研究所及六家地級市結(jié)核病防治機構(gòu)（簡稱結(jié)防機構(gòu)）（東莞市慢性病防治院、佛山市慢性病防治院、惠州市慢性病防治院、江門市慢性病防治院、汕頭市慢性病防治院及廣州番禺區(qū)慢性病防治站）的不同肺部疾病患者及健康人（均提供知情同意書），收集采取上述對象的清晨深部咯出痰液。標本采用順序納入的方式納入2129例樣本（樣本量估算采用美國CDC提供的Epi InfoTM軟件，計算最低樣本量為1282例）。根據(jù)肺結(jié)核及其他肺部疾病的臨床診斷標準，即綜合病史、癥狀、體征、細菌學(xué)檢查、X線胸片等輔助檢查，以及診斷性治療效果等確診患者1327例為肺結(jié)核患者；581例為其他肺部疾病患者［包括上部呼吸道感染138例，慢性肺炎191例，哮喘、支氣管擴張及慢性阻塞性肺疾病193例，非結(jié)核分枝桿菌（NTM）感染引起的肺部疾病38例，不明原因的短期咳嗽、咯痰21例］；221名為健康人群。痰標本要足量（＞2ml），4℃保存，存放時間不超過2d。每一份痰標本分別采用直接抗酸染色法，羅氏固體培養(yǎng)法和LAMP法檢測。同時另選取337例肺結(jié)核患者痰標本先做濃縮處理后進行qPCR及LAMP法檢測。

二、標本處理

痰標本按照結(jié)核病細菌學(xué)檢驗規(guī)程進行前處理。直接堿處理法：向痰液中加入等體積的4%氫氧化鈉溶液，渦旋震蕩器震蕩，使標本液化均勻，在15～20min時間段內(nèi)完成羅氏培養(yǎng)和LAMP檢測的操作；中和離心法（濃縮法）：向痰液中加入等體積前處理液（等體積4%氫氧化鈉和2.94%的檸檬酸三鈉混合，加N－乙酰半胱氨酸至其終濃度為1%），渦旋震蕩器震蕩，使標本勻化，室溫靜置15min，離心，沉淀用PBS溶解，再離心洗滌后加入50μl DNA提取液充分混勻，沸水浴10min，10 000g離心2min，收集上清用于qPCR和LAMP檢測。

三、痰涂片和培養(yǎng)

痰標本采用萋－尼抗酸染色法，按照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》進行操作及鏡檢報告。

痰培養(yǎng)采用改良羅氏培養(yǎng)基堿處理后直接接種法。取前處理后的標本0.1ml，無菌操作接種于培養(yǎng)基斜面上，每份標本同時接種在兩管培養(yǎng)基上。放置于37℃培養(yǎng)箱中孵育。接種后3周觀察菌落生長情況，然后每周觀察結(jié)果一次。發(fā)現(xiàn)菌落生長者，可報告Mtb培養(yǎng)陽性，若滿8周仍無菌落生長，則報告培養(yǎng)陰性。

痰標本陽性與陰性定義：結(jié)核分枝桿菌陽性（true-positive）痰標本是指：（1）培養(yǎng)陽性且鑒定為Mtb；（2）培養(yǎng)陰性但涂片陽性，LAMP陽性且結(jié)合臨床表征診斷為結(jié)核病患者的標本。結(jié)核分枝桿菌陰性（true-negative）：（1）培養(yǎng)和涂片檢測均為陰性；（2）涂片陰性，培養(yǎng)陽性，但菌鑒結(jié)果為NTM菌群。

四、LAMP檢測

Mtb核酸檢測試劑盒（DNA恒溫擴增法）試劑盒由廣州迪澳生物科技有限公司提供（試劑盒引物見表1），按照試劑盒操作說明，將反應(yīng)液60～65℃下反應(yīng)60min，反應(yīng)完成后立刻在80℃下進行反應(yīng)終止。每輪反應(yīng)均進行陽性及陰性對照反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，通過肉眼進行觀察，橙色表示結(jié)果為陰性，綠色表示結(jié)果為陽性（圖1）（注：本實驗的LAMP法檢測Mtb的特異度、敏感度、穩(wěn)定性等方面的優(yōu)化工作由本課題合作團隊早期完成，相關(guān)論文已發(fā)表［6］）。

表1 LAMP法檢測Mtb的引物

五、熒光定量PCR試劑盒

Mtb熒光定量PCR檢測試劑盒購自中山大學(xué)達安基因股份有限公司，按照試劑盒說明書進行操作。向PCR反應(yīng)管［已含有耐熱DNA聚合酶、緩沖液（buffer）和脫氧核苷酸（dNTP）］中加入上述煮沸法提取的DNA模板2μl。PCR擴增程序為：93℃預(yù)變性2min，93℃30s，55℃45s，循環(huán)40次，72℃5min。

六、操作流程及質(zhì)量控制

（1）LAMP-Mtb檢測反應(yīng)體系的建立和條件優(yōu)化工作由廣東省結(jié)核病防治研究所和華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院共同完成。（2）臨床驗證實驗由6家臨床單位的臨床醫(yī)生和檢驗技師共同完成。所有參與醫(yī)師及檢驗技師經(jīng)過專項的培訓(xùn)，通過直接涂片抗酸染色、羅氏固體培養(yǎng)及LAMP檢測的熟練度測試合格后進入實驗。（3）所有試驗的涂片、培養(yǎng)及LAMP反應(yīng)的產(chǎn)物及結(jié)果由廣東省結(jié)核病防治研究所按照數(shù)字表法隨機抽取復(fù)檢：涂片復(fù)染色后復(fù)檢、培養(yǎng)的陽性菌株的Mtb或NTM菌種鑒定及LAMP再次擴增。

七、統(tǒng)計學(xué)處理方法

本研究數(shù)據(jù)采用Office 2010收集整理，采用SPSS統(tǒng)計軟件的Wilcoxon秩和檢驗比較三種檢出率的差異性；采用配對卡方檢驗（McNemar Test）和Kappa檢驗（下同）分析三種檢測方法的一致性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、抗酸染色涂片法、羅氏培養(yǎng)法和LAMP法檢出率比較

對2129例痰標本分別用涂片法、羅氏培養(yǎng)法和LAMP三種方法檢測 Mtb，結(jié)果見表2，涂片陽性294例［經(jīng)硝基苯甲酸 （PNB）及噻吩-2-羧酸肼（TCH）試驗鑒別282例為 Mtb，12例為NTM］，陽性率為13.2%（282／2129）；羅氏培養(yǎng)陽性485例（經(jīng)PNB／TCH 試驗鑒別463例為 Mtb，22例為NTM），陽性率為21.7%（463／2129）；LAMP擴增陽性506例（432例為Mtb，74例為假陽性），陽性率為20.3%（432／2129）。LAMP與抗酸染色涂片法的陽性檢測率不同，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z＝6.565，P＝0.000＜0.05）；LAMP與羅氏培養(yǎng)法的陽性檢測率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z＝1.273，P＝0.203＞0.05）（表2）。

圖1 LAMP反應(yīng)結(jié)果圖

表2 直接涂片抗酸染色法、羅氏培養(yǎng)法及LAMP法檢測效果［例或名（占有率，%）］

表3 不同檢測單位直接涂片法、羅氏培養(yǎng)法及LAMP法檢測結(jié)核分枝桿菌的差異性分析

上述結(jié)果說明LAMP法比臨床最主要的檢測方法——涂片法的陽性檢出率高，且同結(jié)核病診斷參考標準——羅氏培養(yǎng)法相比，陽性檢出率效果相當。

二、三種檢測方法的檢出效能的差異性分析

432例LAMP陽性標本被確診為Mtb陽性（True-positive）；1530例 LAMP陰性標本被確診為Mtb陰性（true negative）；53例 LAMP陰性（22例涂片陽性，31例培養(yǎng)陽性且鑒定為Mtb）被確定為假陰性（false-negative）；74例LAMP陽性（其中，12例抗酸染色涂片和培養(yǎng)均陽性，10例培養(yǎng)陽性標本經(jīng)［經(jīng)硝基苯甲酸（PNB）及噻吩-2-羧酸肼（TCH）試驗鑒別鑒別為NTM；52例培養(yǎng)和涂片均為陰性被診斷為肺部其他感染性疾病）被確定為LAMP假陽性（false-positive）。LAMP法靈敏度、特異度、陽性和陰性預(yù)測值分別為87.0%～94.4%（總體為89.1%）、92.9%～97.0%（總體為95.5%）、83.1%～88.2%（總體為85.4%）和96.1%～97.9%（總體為96.7%），說明LAMP在臨床應(yīng)用具有很高的診斷效能，與羅氏培養(yǎng)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。

三、LAMP法同抗酸染色涂片法、羅氏培養(yǎng)法和qPCR檢測方法的一致性分析

1.將LAMP法與抗酸染色涂片法檢測Mtb的結(jié)果對比：兩種檢測方法結(jié)果的一致性為87.9%，預(yù)期結(jié)果的一致性為68.9%，Kappa值為0.612（P＝0.021＜0.05），Kappa值介于0.61～0.80之間，說明兩種檢測方法結(jié)果大部分一致（表4）。

2.LAMP法與培養(yǎng)法檢測結(jié)果比較：LAMP法和培養(yǎng)法的檢測結(jié)果的一致性為96.1%，預(yù)期結(jié)果的一致性為64.2%，Kappa值為0.89（P＝0.012＜0.05），說明這兩種檢測方法結(jié)果完全一致（表5）。

表4 LAMP法與直接涂片法檢測Mtb的一致性分析（例或名）

表5 LAMP法與羅氏培養(yǎng)法檢測Mtb的一致性分析（例或名）

3.LAMP法與qPCR法檢測結(jié)果比較：分別從廣州市和汕頭市選擇的337例結(jié)核病患者的痰標本，先進行中和離心（濃縮）后，再做LAMP法與qPCR法檢測。檢測結(jié)果為：LAMP法的陽性檢出率為35.9% （121／337），qPCR法的陽性率為35.0%（118／337）；兩種方法檢測結(jié)果的一致性為91.4%，預(yù)期結(jié)果的一致性為54.2%，Kappa值為0.812＞0.8（P＝0.033＜0.05），說明這兩種檢測方法的檢測效果完全一致（表6）。

表6 LAMP法與qPCR法檢測Mtb的一致性分析（例或名）

討 論

根據(jù)2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果［7］，估算我國全人群活動性肺結(jié)核患病率為392／10萬，其中傳染性肺結(jié)核患病率為100／10萬，也就是說我國平均每10萬人口中約有400名活動性肺結(jié)核患者，其中有1／4具有傳染性。據(jù)此估算2010年我國現(xiàn)有活動性肺結(jié)核患者總數(shù)為523萬，其中傳染性肺結(jié)核患者總數(shù)為134萬。由目前的趨勢預(yù)計，到2020年結(jié)核病仍將是全球重大傳染病之一。

研究和開發(fā)快速、簡便、敏感度好、特異度高的Mtb新的檢測方法成為亟待解決的問題。目前也涌現(xiàn)出一批具有一定市場應(yīng)用前景的技術(shù)方案，例如反向雜交線性探針技術(shù)、Gene-Expert技術(shù)、基因芯片技術(shù)等，這些大部分仍處于實驗室開發(fā)和臨床前驗證階段。然而，在發(fā)展中國家，尤其是結(jié)核病發(fā)病率較高的中國、印度、巴基斯坦等國［7］，上述檢測方法的技術(shù)要求，儀器昂貴等問題將成為廣泛推廣的瓶頸。等溫擴增技術(shù)在日本、歐洲等國家得到廣泛研究和開發(fā)，但是到目前為止仍處于實驗室或者臨床前評估階段［8－17］，反應(yīng)試劑的開發(fā)仍處于實驗室摸索階段，未能達到穩(wěn)定性強、敏感度和特異度都能夠適合臨床應(yīng)用的水平［18］。

本課題組研究的創(chuàng)新性在于成功實現(xiàn)了LAMP技術(shù)從實驗室研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，在技術(shù)的穩(wěn)定性、方法的靈敏度及特異度方面均取得了令人滿意的結(jié)果。相比其他報道，本研究團隊經(jīng)過近8年的研究，開發(fā)出一套完整、穩(wěn)定的等溫擴增的反應(yīng)體系和技術(shù)。筆者開發(fā)的針對Mtb的等溫擴增試劑盒及檢測技術(shù)在廣東省6家地市結(jié)核病防治專業(yè)醫(yī)院完成了的臨床應(yīng)用及驗證評估，并取得了可喜的效果。本研究大大推進了LAMP技術(shù)在臨床應(yīng)用，全面推廣指日可待。其優(yōu)勢主要表現(xiàn)在以下幾個方面：（1）提高肺結(jié)核患者的陽性檢出率：同直接涂片抗酸染色相比，痰液中Mtb的陽性檢出率提高了64.3%（P＜0.05）；（2）檢測速度快：等溫擴增法的診斷效能幾乎等同于羅氏培養(yǎng)法，但是其檢出時間僅僅需要1h左右，大大降低了診斷延誤的時間和幾率；（3）操作方法簡單，無需特殊儀器：等溫擴增的操作沒有傳統(tǒng)PCR復(fù)雜和技術(shù)要求嚴格，同時不需要昂貴的擴增儀器；（4）實驗室交叉污染風(fēng)險低：整個反應(yīng)始終在密閉的環(huán)境（無需打開管蓋），最終通過肉眼辨別顏色變化來判斷結(jié)果，如果實驗人員不出現(xiàn)操作失誤（打開擴增產(chǎn)物的管蓋），該方法幾乎不存在擴增產(chǎn)物的氣溶膠污染實驗室的情況發(fā)生，在本研究臨床驗證的過程中，筆者多次對實驗室的環(huán)境和水樣做針對IS6110片段的PCR檢測實驗，未發(fā)現(xiàn)假陽性產(chǎn)生，說明實驗室沒有受到等溫擴增的產(chǎn)物污染；（5）本研究臨床驗證的實驗均由各自實驗室的技術(shù)人員獨立完成，雖然不同實驗室的實驗室環(huán)境、操作人員的技術(shù)水平和熟練度均存在一定差異，但最終的檢測報告顯示各自實驗室的檢測結(jié)果的差異性不具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明筆者研究團隊開發(fā)的等溫擴增方法具有一定穩(wěn)定性，具備了大面積使用的潛能，甚至可以在社區(qū)醫(yī)院或者鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院開展。

隨著肺結(jié)核的反復(fù)發(fā)作及治療病程的延長，部分患者肺部感染為分枝桿菌復(fù)合菌群，甚至是Mtb和NTM復(fù)合感染。對于本試驗中出現(xiàn)22例LAMP檢測假陽性（鑒定為NTM菌）的患者，通過回復(fù)性觀察，發(fā)現(xiàn)有17例抗結(jié)核治療效果顯著；同時對22例NTM陽性產(chǎn)物進行分離培養(yǎng)，并再次LAMP試驗，僅發(fā)現(xiàn)7例LAMP陽性。因此，筆者高度懷疑其中多數(shù)患者同時伴有Mtb和NTM復(fù)合感染，為今后的相關(guān)研究提供了一種啟示。

本研究的試驗試劑只是針對人型Mtb進行檢測，因此無法檢測出Mtb復(fù)合菌群的其他類型及其他致病性的環(huán)境分枝桿菌，這在一定程度上影響了該方法的臨床檢出效能。隨著結(jié)核病發(fā)現(xiàn)力度的加大和控制水平的提高，一方面臨床上NTM感染引起的疑似結(jié)核病患者逐漸增多，迫切需要實驗室能夠檢測具體致病菌型；另一方面臨床醫(yī)生往往希望通過對菌株的活力及死活狀態(tài)的判斷來評估抗結(jié)核的效果。因此，開發(fā)出能夠同時檢測出多種分枝桿菌及能夠鑒別死活菌的等溫擴增試劑將成為下一步研究的重點。

［1］Hale YM，Pfyffer GE，Salfinger M.Laboratory diagnosis of mycobacterial infections：new tools and lessons learned.Clin Infect Dis，2001，33（6）：834-846.

［2］Pandey BD，Poudel A，Yoda T，et al.Development of an inhouse loop-mediated isothermal amplification（LAMP）assay for detection ofMycobacterium tuberculosisand evaluation in sputum samples of Nepalese patients.J Med Microbiol，2008，57（Pt 4）：439-443.

［3］Hillemann D，Warren R，Kubica T，et al.Rapid detection ofMycobacterium tuberculosisBeijing genotype strains by real-time PCR.J Clin Microbiol，2006，44（2）：302-306.

［4］Haldar S，Chakravorty S，Bhalla M，et al.Simplified detection ofMycobacterium tuberculosisin sputum using smear microscopy and PCR with molecular beacons.J Med Microbiol，2007，56（Pt 10）：1356-1362.

［5］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res，2000，28（12）：E63.

［6］林世平，楊應(yīng)周，譚衛(wèi)國，等.環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法快速檢測結(jié)核分枝桿菌的初步觀察.中國防癆雜志，2010，32（8）：467-469.

［7］衛(wèi)生部召開新聞發(fā)布會介紹全國肺結(jié)核疫情現(xiàn)狀（DB／OL）.［2011-03-21］.http：／／www.gov.cn／gzdt／2011-03／21／content＿1828718.htm.

［8］Aryan E，Makvandi M，F(xiàn)arajzadeh A，et al.A novel and more sensitive loop-mediated isothermal amplification assay targeting IS6110for detection ofMycobacterium tuberculosiscomplex.Microbiol Res，2010，165（3）：211-220.

［9］Geojith G，Dhanasekaran S，Chandran SP，et al.Efficacy of loop mediated isothermal amplification（LAMP）assay for the laboratory identification ofMycobacterium tuberculosisisolates in a resource limited setting.J Microbiol Methods，2011，84（1）：71-73.

［10］Lange C，Mori T.Advances in the diagnosis of tuberculosis.Respirology，2010，15（2）：220-240.

［11］Broccolo F，Scarpellini P，Locatelli G，et al.Rapid diagnosis of mycobacterial infections and quantitation ofMycobacterium tuberculosisload by two real-time calibrated PCR assays.J Clin Microbiol，2003，41（10）：4565-4572.

［12］Lopez AD，Mathers CD，Ezzati M，et al.Global and regional burden of disease and risk factors，2001：systematic analysis of population health data.Lancet，2006，367（9524）：1747-1757.

［13］Shrestha NK，Tuohy MJ，Hall GS，et al.Detection and differentiation ofMycobacterium tuberculosisand nontuberculous mycobacterial isolates by real-time PCR.J Clin Microbiol，2003，41（11）：5121-5126.

［14］Liu KT，Su WJ，Perng RP.Clinical utility of polymerase chain reaction for diagnosis of smear-negative pleural tuberculosis.J Chin Med Assoc，2007，70（4）：148-151；discussion 146-147.

［15］Iwamoto T，Sonobe T，Hayashi K.Loop-mediated isothermal amplification for direct detection ofMycobacterium tuberculosiscomplex，M.avium，and M.intracellulare in sputum samples.J Clin Microbiol，2003，41（6）：2616-2622.

［16］Scarparo C，Piccoli P，Rigon A，et al.Comparison of enhancedMycobacterium tuberculosisamplified direct test with COBAS AMPLICORMycobacterium tuberculosisassay for direct detection ofMycobacteriumtuberculosiscomplex in respiratory and extrapulmonary specimens.J Clin Microbiol，2000，38（4）：1559-1562.

［17］Mathema B，Kurepina NE，Bifani PJ，et al.Molecular epidemiology of tuberculosis：current insights.Clin Microbiol Rev，2006，19（4）：658-685.

［18］George G，Mony P，Kenneth J.Comparison of the efficacies of loop-mediated isothermal amplification，fluorescence smear microscopy and culture for the diagnosis of tuberculosis.PLoS One，2011，6（6）：e21007.

Clinical application of loop-mediated isothermal amplification method in rapid detection ofMycobacterium tuberculosis

CHEN Tao＊，ZHOU Lin，ZHOU Jie，LI Hai-cheng，JIANG Yong，PENG Dong-dong，ZHOU Zhi-gang，PENG Jian-ming，WEN Li，HE Chao-wen，QIAN Ming，SUN Yi-fan，SHI Lei，ZHONG Qiu.＊Center for Tuberculosis Control and Prevetion of Guangdong Province，Guangzhou 106130，China

ZHONG Qiu，Email：zhongqiu＠vip.163.com；ZHOU Lin，Email：gdtb＿bg＠vip.163.com

ObjectiveTo evaluate the diagnostic value of a loop-mediated isothermal amplification（LAMP）method for rapid detection ofMycobacterium tuberculosis.Methods2129sputum samples of suspected TB patients from 6cities in Guangdong province and 337enriched sputum samples randomly selected from Guangzhou and Shantou cities were collected.M.tuberculosisin 2129sputum samples were detected by smear，Roche solid culture and LAMP methods.M.tuberculosisin 337sputum samples were detected by quantitative polymerase chain reaction（qPCR）and LAMP methods. Results For 2129sputum samples，the positive rates of smear，culture and LAMP were 13.2%（282／2129），21.7%（463／2129）and 20.3%（432／2129），respectively.Compared with Roche culture method，sensitivity，specificity，positive predictive value and negative predictive value of the LAMP method were 89.1%（432／485），95.5%（1570／1644），85.4%（432／506）and 96.7%（1570／1623），respectively.For 337enriched sputum samples，the positive rates of qPCR and LAMP were 35.0% （118／337）and 35.9% （121／337），respectively.Compared LAMP with smear，culture and qPCR，the consistent rate of the results were 87.9%（K＝0.612），96.1%（K＝0.89）and 91.4%（K＝0.812），respectively. Conclusion The LAMP method was equivalent to culture and qPCR，superior to smear method in detectingM.tuberculosisof sputum specimens.In addition，LAMP method showed the advantages of rapid，simple operation and no equipment，indicating good prospects for clinical application and promotion in the diagnosis of tuberculosis.

Mycobacterium tuberculosis； Nucleic acid amplification techiques

“十二五”國家科技重大專項（2012ZX10004903）；“十二五”廣東省“結(jié)核病防治轉(zhuǎn)化”醫(yī)學(xué)重點實驗室

106130廣州，廣東省結(jié)核病控制中心參比實驗室（陳濤、周琳、李海成、江勇、錢明、鐘球）；廣東省佛山市第四人民醫(yī)院（周杰）；廣東省汕頭市結(jié)核病防治所（彭東東）；廣東省東莞市慢性病防治院（周志剛）；廣東省惠州市結(jié)核病防治所（彭建明）；廣東省江門市結(jié)核病防治所（文力）；廣州市番禺區(qū)慢性病防治站（何超文）；暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室（孫毅凡）；華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院（石磊）

鐘球，Email：zhongqiu＠vip.163.com；周琳，Email：gdtb＿bg＠vip.163.com

2012-05-16）

（本文編輯：薛愛華）