湯 強(qiáng) 方 玲 章玉萍

(1蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽蕪湖 241003;2安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所，安徽合肥 230061)

家蠶G蛋白α亞基基因BmGα73B原核表達(dá)及其表達(dá)條件優(yōu)化

湯 強(qiáng)1方 玲1章玉萍2

(1蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽蕪湖 241003;2安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所，安徽合肥 230061)

通過(guò)RT-PCR技術(shù)從家蠶中擴(kuò)增出G蛋白α亞基基因BmGα73B的cDNA，克隆至原核表達(dá)載體pET-41b(+)中，所獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后，將其轉(zhuǎn)化至E coli BL21誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE與Western blot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為1 158 bp的蛋白基因，誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒pET-41b(+)-Gα73B，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，IPTGr的終濃度為1 mmol/L時(shí)，誘導(dǎo)4 h時(shí)蛋白表達(dá)量最高，出現(xiàn)分子質(zhì)量約為73 kD的目的蛋白帶，與蛋白的理論值相符。經(jīng)Western blot檢測(cè)，表達(dá)產(chǎn)物可與GST發(fā)生特異性反應(yīng)。

G蛋白α亞基;BmGα73B;RT-PCR;克隆;原核表達(dá)

異三聚體G蛋白(heterotrimeric GTP-binding protein，簡(jiǎn)稱G蛋白)家族在昆蟲多種特異的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起著十分重要的作用，如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、光、藥物等特異作用信息都是通過(guò)細(xì)胞膜受體與G蛋白偶聯(lián)，從而傳遞至細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生各式各樣的生理反應(yīng)［1－2］。G 蛋白是由 α、β和 γ3個(gè)亞基組成，在自然狀態(tài)下，β與γ亞基始終以二聚體的形態(tài)結(jié)合在一起，并通過(guò)γ亞基定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，只有在變性條件下才能分開(kāi)。根據(jù)G蛋白的結(jié)構(gòu)、氨基酸序列及其進(jìn)化相似性和功能等可將其分為Gs、Gi、Gq和G12這4個(gè)家族［3］。其調(diào)節(jié)的下游效應(yīng)器有腺苷酸環(huán)化酶，cGMP磷酸二脂酶，磷酸肌醇3－激酶，PI-PLCP，Na+/H+泵，TUBBY 轉(zhuǎn)錄因子，離子通道等［4］。不同的G蛋白能特異地將受體和與之相適應(yīng)的效應(yīng)酶偶聯(lián)起來(lái)。

家蠶(Bombyx mori)作為重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是繼果蠅(Drosophila melanogaster)之后又一個(gè)適用于現(xiàn)代生命科學(xué)研究的模式昆蟲。目前已有一些關(guān)于家蠶G蛋白的研究報(bào)道，其中包括對(duì)5個(gè)G蛋白α亞基基因及其功能的研究［5－7］。家蠶G蛋白亞基基因BmGα73B是一個(gè)組織時(shí)空特異性表達(dá)的基因，在中腸組織中表達(dá)量最高，在家蠶的不同發(fā)育時(shí)期中，轉(zhuǎn)錄水平峰值出現(xiàn)在幼蟲期，而在預(yù)蛹期、蛹后期和成蟲期幾乎沒(méi)有表達(dá)，BmGα73B基因可能在家蠶生長(zhǎng)前期的中腸發(fā)育信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要的作用［7］。本研究利用RT-PCR技術(shù)，將BmGα73B基因成熟肽克隆到pET-41b(+)中，通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-41b-Gα73B對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，為今后利用基因工程方法研究其功能及活性奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

pET-41b(+)質(zhì)粒、宿主菌 E.coli DH5、BL21(DE3)，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省微生物重點(diǎn)防治實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

Trizol，購(gòu)自Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒，購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;T4DNA連接酶、Ex-Taq酶、DNA限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ，BamHⅠ)、DNA Maker(DL 2 000)、低分子量蛋白質(zhì) Maker，購(gòu)自TaKaRa(大連)公司和上海NEB公司;抗6×GST單克隆抗體，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;硝酸纖維素膜，購(gòu)自Sigma公司;其它化學(xué)藥品均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)編碼BmGα73B基因的氨基酸序列，利用軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物。斜體堿基為酶切位點(diǎn)，下劃線堿基為保護(hù)堿基。正向引物BmGα73B-F:5'-C GAATTC TACAATGCGCTTGCTACCCTG－3'，反向引物BmGα73B-R:5'-CCC AAGCTTTCAATAAACGCCTATATTATTGAG-3'。

1.4 家蠶總RNA提取和RT-PCR擴(kuò)增

按Invitrogen Trizol?試劑盒說(shuō)明提取5齡第1天家蠶幼蟲中腸的RNA，然后以RNA為模板，按TOYOBO反轉(zhuǎn)錄酶的使用說(shuō)明進(jìn)行cDNA第1鏈的合成。以家蠶cDNA為模板，用引物BmGα73B-F/BmGα73B-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件:94℃ 30 s;55℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán);擴(kuò)增結(jié)束10 min后，4℃保存。PCR產(chǎn)物回收純化后，進(jìn)行TA克隆(TaKaRa，pMD18-T載體，大腸桿菌 DH5α)，陽(yáng)性克隆通過(guò)鑒定后送Invitrogen公司測(cè)序。

1.5 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切空質(zhì)粒pET-41b(+)和pT-Gα73B，分別回收目的片段與線性化載體片段后，用T4DNA連接酶連接12 h，構(gòu)建融合表達(dá)載體pET-41b(+)-Gα73B并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)。陽(yáng)性克隆通過(guò)鑒定后送Invitrogen公司測(cè)序。

1.6 原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)12 h，按1∶100的比例將培養(yǎng)的菌液加到新鮮的含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至D600nm為0.6～0.8，分別加入異丙基 β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.01、0.10、0.50、1.00、1.50 和 2.00 mmol/L 進(jìn)行誘導(dǎo)。此外，在添加相同濃度的 IPTG 誘導(dǎo)的1、2、3、4、5 h內(nèi)分別取樣處理，用12%SDS-PAGE電泳分析。重組pET-41b(+)-Gγ30A菌液10 mL，在 IPTG濃度為0.01 mmol/L、37℃下誘導(dǎo)4 h后，收集菌液13 000 g離心1 min，加入1 mL PBS重懸沉淀，重懸的菌液在冰浴下用超聲破碎菌體，離心收集上清和沉淀，分別進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

1.7 Western blot鑒定融合蛋白

取適量誘導(dǎo)融合蛋白超聲破碎后的上清，經(jīng)SDS-PAGE后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，利用目的蛋白上的GST標(biāo)簽肽，進(jìn)行Western blot分析，以未誘導(dǎo)的融合蛋白作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 BmGα73B基因的RT-PCR擴(kuò)增

RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)出長(zhǎng)約1 158 bp片斷，與預(yù)計(jì)的基因大小相符(圖1)。

圖1 PCR擴(kuò)增的家蠶G蛋白α亞基BmGα73B基因產(chǎn)物

2.2 重組表達(dá)載體的酶切鑒定

陽(yáng)性克隆經(jīng)EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，在1 100 bp左右處能切出DNA目的片段，大小與目地蛋白基因一致(圖2)。測(cè)序結(jié)果顯示，插入片段為1 158 bp，與開(kāi)始測(cè)序獲得BmGα73B基因編碼框序列相同，兩者同源性為100%。

圖2 表達(dá)載體pET-41b-Gα73B的雙酶切鑒定

2.3 重組蛋白的表達(dá)

SDS-PAGE顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET-41b(+)-Gα73B菌體表達(dá)出約38 kD大小特異的融合蛋白條帶，與理論預(yù)測(cè)值相一致，即GST與Gα73B的融合蛋白。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的越來(lái)越長(zhǎng)，蛋白的表達(dá)量也越來(lái)越大，當(dāng)其誘導(dǎo)后4 h時(shí)，融合蛋白的表達(dá)量最大(圖3-A)。工程菌在 IPTG的終濃度分別為0.01、0.10、0.50、1.00、1.50 和 2.00 mmol/L、37 ℃條件下誘導(dǎo)3 h后，結(jié)果顯示蛋白的表達(dá)量沒(méi)有明顯的變化(圖3-B)。

2.4 誘導(dǎo)融合重組蛋白的表達(dá)方式

誘導(dǎo)后的融合蛋白經(jīng)超聲波破碎、離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，利用目的蛋白上的GST標(biāo)簽肽，進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果在上清和沉淀中都可檢測(cè)到目的蛋白，說(shuō)明該蛋白有可溶性和包涵體2種表達(dá)方式(圖4)。

2.5 Western blot分析重組蛋白

誘導(dǎo)的重組蛋白破碎后沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移到Nc膜，Western blot結(jié)果顯示，重組蛋白可與抗6GST-tag多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，其分子量大小約為73 kD，與實(shí)驗(yàn)預(yù)期的一致(圖5)。

圖5 重組菌BL21(DE3)-pET-41b-Ga73B的W estern blot分析

3 討論

GST基因融合表達(dá)系統(tǒng)廣泛用于各種融合蛋白的表達(dá)，它包含一系列的表達(dá)載體，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細(xì)胞中表達(dá)，其表達(dá)的蛋白質(zhì)帶有GST頭部，可利用含有還原型谷胱甘肽的純化柱進(jìn)行純化，得到純的融合蛋白［8］。本研究成功構(gòu)建了pET-41b(+)-BmGα73B融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coli BI21宿主菌細(xì)胞中，以IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，使GST-BmGα73B融合蛋白獲得了高效表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GST-BmGα73B在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)，用含抗GST的標(biāo)簽對(duì)融合蛋白的菌體裂解后的沉淀進(jìn)行了Western blot印跡分析，結(jié)果表明GST-BmGα73B特異地被抗GST的抗體識(shí)別，從而證實(shí)GST-BmGα73B在大腸桿菌BL21內(nèi)成功表達(dá)。在發(fā)酵條件摸索實(shí)驗(yàn)中，我們主要是對(duì)溫度梯度、時(shí)間梯度和誘導(dǎo)劑濃度梯度進(jìn)行分析［9］，結(jié)果顯示工程菌誘導(dǎo)4 h后，融合蛋白表達(dá)量最大，而誘導(dǎo)劑濃度對(duì)融合蛋白的表達(dá)量沒(méi)有什么影響。

大腸桿菌被內(nèi)膜和外膜隔開(kāi)形成胞內(nèi)、周質(zhì)和胞外3個(gè)部分。根據(jù)表達(dá)部位的不同可將蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)形式分為3種:胞外分泌、周質(zhì)空間表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)。胞內(nèi)表達(dá)易形成無(wú)活性的包涵體，包涵體是外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)表達(dá)產(chǎn)物聚集在一起形成的直徑大約0.5～1.0μm的折光小體［10］。由于在重組蛋白表達(dá)過(guò)程中，大腸桿菌缺乏蛋白折疊過(guò)程需要的酶和輔助因子，而無(wú)法形成正確的次級(jí)鍵來(lái)進(jìn)行正確折疊，所以包涵體是重組蛋白非天然形式的混合物［11］，因此沒(méi)有生物學(xué)活性。包涵體難溶與水，只溶于變性劑如尿素中，必須經(jīng)過(guò)繁瑣的變性、復(fù)性過(guò)程才能得到具有生物學(xué)活性的重組蛋白。而周質(zhì)空間表達(dá)，有利于蛋白質(zhì)的正確折疊，更有可能產(chǎn)生目的蛋白的天然N末端，這對(duì)后續(xù)的蛋白功能研究工作是極其重要的。提高重組蛋白可溶性表達(dá)的方法有選擇適合的載體與宿主菌，降低重組蛋白合成的速率，改變培養(yǎng)基成分與分子伴侶或折疊酶供表達(dá)、通過(guò)替換氨基酸增加可溶性等［12－13］。本研究獲得的 GST-BmGα73B主要以包涵體形式存在，后期蛋白純化研究還需要進(jìn)一步的探索。

［1］Cabrera-Vera TM，Vanhauwe J，Thomas TO，et al.Insights into G protein structure，function，and regulation［J］.Endocr Rev，2003，24(6):765－881.

［2］Neves SR，Ram P T，Iyengar R.G protein pathways［J］.Science，2002，296:1 636－1 639.

［3］Downes G B，Gautam N.The G protein subunit gene families［J］.Genomics，1999，62(3):544－552.

［4］Assmann SM.Heterotrimeric and unconventional GTP binding proteins in plant cell singaling［J］.The Plant Cell，2002，355－373.

［5］Miura N，Atsumi S，Tabunoki H，et al.Expression and localization of three G protein α subunits，Go，Gq，and Gs，in adult antennae of the silkmoth(Bombyx mori)［J］.J Comp Neurol，2005，485:143－152.

［6］章玉萍，湯強(qiáng)，趙云坡，等.家蠶G蛋白α亞基基因BmGα12的克隆及序列分析與融合表達(dá)［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2011，37(2):312－319.

［7］章玉萍，蔣劍豪，張建設(shè)，等.家蠶 G蛋白 α亞基基因BmGα73B的克隆與表達(dá)［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2008，51(8):785－791.

［8］章玉萍，蔣劍豪，趙云坡，等.家蠶G蛋白γ亞基BmGγ1的克隆其GST融合蛋白的表達(dá)和純化［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2008，34(4):627－633.

［9］陳衛(wèi)，葛佳佳，張顴，等.半乳糖昔酶基因在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)及IPTG誘導(dǎo)條件［J］.無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，21(5):492－495.

［10］李軍，李伯良.蛋白A信號(hào)肽引導(dǎo)的E.coli外泌高表達(dá)異源蛋白［J］.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1995，27(6):616－623.

［11］Katsuyoshi K，Yoshitaka N，Satoru K，et al.Cloning and expression of Bombyx mori gland elongation factor1 in escherichia coli［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2002，66(3):558－565.

［12］董旭，新毅.重組蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的策略［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29(4):393－395.

［13］余波，程安春，汪銘書.大腸桿菌中重組蛋白可溶性表達(dá)的研究進(jìn)展及展望［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008，(10):19－21.

S881.2

A

1007－0982(2012)03－0019－04

2012－03－30;

2012－06－20

安徽省高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào) KJ2012B218);安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)青年創(chuàng)新基金項(xiàng)目(編號(hào)11B0625);安徽省蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目。

湯強(qiáng)(1981—)，男，安徽蕪湖，博士。

Tel:0553－5777156，E-mail:tqiang226@126.com

章玉萍(1981—)，女，安徽合肥，博士。

Tel:0551－2840193，E-mail:ypzhang6330@163.com