徐曉峰 周秀敏 董杰 張征宇 葛京平 周文泉 魏武程文 位志峰 侯建全 高建平*

1. 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院泌尿外科，江蘇 南京 210002；2. 蘇州大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，△泌尿外科，江蘇 蘇州 215006

下調(diào)PAR基因表達對前列腺癌PC3細胞周期及Cdc25C蛋白表達的影響

徐曉峰1△周秀敏2董杰1張征宇1葛京平1周文泉1魏武1程文1位志峰1侯建全△高建平1*

1. 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院泌尿外科，江蘇 南京 210002；2. 蘇州大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，△泌尿外科，江蘇 蘇州 215006

背景與目的：前列腺雄激素調(diào)節(jié)基因(prostate androgen regulated gene，PAR)在雄激素非依賴性前列腺癌中特異性高表達，可能與細胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)。本研究用RNA干擾技術(shù)下調(diào)PAR基因表達，并探討其對前列腺癌PC3細胞細胞周期及調(diào)節(jié)因子Cdc25C表達的影響。方法：針對PAR基因的siRNA轉(zhuǎn)染PC3細胞，以RT-PCR驗證其對PAR基因表達抑制的有效性，用流式細胞術(shù)檢測細胞周期，Western blot檢測Cdc25C表達水平。結(jié)果：siRNA轉(zhuǎn)染可抑制PC3細胞PAR基因表達，同時G2/M期細胞及凋亡細胞比例分別由(23.79±3.16)%及(1.49±0.13)%增加至(29.95±3.25)%和(20.61±2.73)%，Cdc25C蛋白表達水平明顯下降。結(jié)論：PAR基因表達下調(diào)可誘導細胞G2/M期阻滯和凋亡，抑制細胞周期調(diào)節(jié)因子Cdc25C的表達。

PAR基因； 前列腺癌； 細胞周期； Cdc25C

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是男性泌尿生殖系常見的惡性腫瘤。在歐美男性中，PCa位居癌癥發(fā)病率之首［1-2］。前列腺雄激素調(diào)節(jié)基因(prostate androgen regulated gene，PAR)是前列腺癌特異性高表達的癌基因，且已有研究提示PAR基因與前列腺癌惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)［3］。

大量研究表明，腫瘤是細胞周期紊亂、細胞生長失控所致的疾病。Cdc25C是調(diào)控細胞周期進入M期的主要效應(yīng)分子。Cdc25C在很多腫瘤中表達上調(diào)，且與腫瘤惡性程度、侵襲能力呈正相關(guān)［4-6］。

本實驗采用RNA干擾技術(shù)抑制PAR基因在前列腺癌細胞系PC3中的表達，研究PC3細胞周期變化并檢測Cdc25C蛋白表達水平，初步分析細胞周期變化的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人前列腺癌細胞株P(guān)C3購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，質(zhì)粒psiRNA-hH1neo購自InvivoGen公司，限制性內(nèi)切酶BbSⅠ購自Fermentas公司，總RNA提取試劑TRIzol和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司，兔抗人的anti-Cdc25C一抗購自Santa Cruz公司，anti-?actin購自Sigma公司，辣根過氧化合物(HRP)偶聯(lián)的羊抗兔二抗購自Promega公司，HRP顯色試劑盒購自Piece公司。

1.2 方法

1.2.1 SiRNA的設(shè)計與合成

從G e n B a n k查得人PA R基因(序列號為A F 1 1 5 8 5 0)序列，根據(jù)s i R N A的設(shè)計原則，選取序列如下：5’-CGTCCTGATAGATCCTCTGCT-3’(核苷酸序列AF115850 257～277)。用BLAST軟件進行分析，未發(fā)現(xiàn)所選取的核苷酸序列與人體其他任何mRNA有同源性。設(shè)計好的序列送上海聯(lián)合基因科技公司合成對應(yīng)的siRNA-P。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和siRNA轉(zhuǎn)染

人前列腺癌細胞株P(guān)C3在含10%小牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)傳代。PC3細胞以3×105個/孔的密度接種于6孔板。當細胞生長密度達到50%～70%時，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，具體操作按試劑說明書進行。實驗組每孔分別加入含有終濃度為50、100和200 nmol/L siRNA-P的OPTI-MEM無血清培養(yǎng)基，同時設(shè)立對照組(轉(zhuǎn)染不針對任何靶基因的siRNA-C)。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)

轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，提取總RNA，以RNA逆轉(zhuǎn)錄后合成的第一條cDNA鏈為模板，進行PCR擴增。PAR基因的引物：上游引物5’-GTCAGCAAGCACCTCAAAT-3’；下游引物5’-GAAGAAGATGGGGAAAAGG-3’。β-actin基因的引物：上游引物5’-GTGCCACC AGACAGCACTGTGTTG-3’；下游引物5’- TGGAGAAGAGCTATGAGCTGCC TG-3’。PAR和β-actin基因的PCR擴增片斷長度分別為451和202 bp。反應(yīng)條件： 94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min(共30個循環(huán))；72 ℃終延伸10 min。擴增后的產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，再經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像，用Gelworks 1D Advanced v4.01軟件進行條帶灰度分析。

1.2.4 流式細胞儀分析細胞調(diào)亡和細胞周期

用siRNA轉(zhuǎn)染PC3細胞，轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，然后用PBS洗滌2次，再以500 μL PBS重懸，加入-20 ℃預冷的85%的乙醇，4 ℃固定過夜。再用PBS洗滌2次，加入100 μL PC緩沖液(phosphate-citric acid buffer；0.2 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L 檸檬酸按192∶8的體積比混勻，pH=7.8)，避光，置于室溫20 min。再以PBS洗滌1次，加PI染液500 μL(含濃度為10 μg/mL的PI和100 μg/mL的RNase A)，避光，置于室溫30 min后上機，用流式細胞儀進行細胞調(diào)亡和細胞周期的檢測。

1.2.5 Western blot檢測

收集細胞，加入150 μL細胞裂解液進行裂解。于冰上裂解20 min，所得裂解液以14 000×g，4 ℃離心1 min。蛋白加上樣緩沖液95 ℃變性5 min后進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，加入兔抗人Cdc25C單克隆抗體，4 ℃過夜，TTBS洗膜4次，加羊抗兔IgG-HRP，室溫雜交1 h，TTBS洗膜4次。用化學發(fā)光法顯色。

1.3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染siRNA對PC3細胞PAR mRNA表達的影響

針對PAR基因的siRNA轉(zhuǎn)染PC3細胞48 h后，RT-PCR結(jié)果顯示PAR mRNA的表達明顯被抑制，且抑制作用隨siRNA濃度增加而增強 (P<0.01，圖1)。

2.2 細胞調(diào)亡和細胞周期變化

轉(zhuǎn)染siRNA后48 h，對照組處于G2/M期的細胞為(23.79±3.16)%，凋亡率為(1.49±0.13)%；實驗組處于G2/M期的細胞為(29.95±3.25)%，凋亡率為(20.61±2.73)%，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義意義(P<0.01，表1，圖2)，說明轉(zhuǎn)染針對PAR基因的siRNA對PC3細胞有明顯的G2/M期阻滯作用，并能夠誘導PC3細胞凋亡。

2.3 轉(zhuǎn)染siRNA對PC3細胞Cdc25C蛋白表達水平的影響

Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染針對PAR基因的siRNA，在50 nmol/L濃度即可觀察到PC3細胞Cdc25C蛋白表達水平下調(diào)，且隨著siRNA轉(zhuǎn)染濃度的增加，抑制Cdc25C蛋白表達的作用亦增強，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖3)。

表 1 PAR基因表達抑制對PC3細胞周期和細胞凋亡的影響Tab. 1 Effects of PAR depletion on PC3 cell cycle distribution[±s(%)]

表 1 PAR基因表達抑制對PC3細胞周期和細胞凋亡的影響Tab. 1 Effects of PAR depletion on PC3 cell cycle distribution[±s(%)]

Cells Sub-G0/G1 G0/G1 S G2-M Control (siRNA-C) 1.49±0.13 55.68±3.20 19.05±2.12 23.79±3.16 siRNA-P 20.61±2.73 29.38±2.17 20.06±2.58 29.95±3.25 Treatment

3 討 論

晚期PCa臨床行內(nèi)分泌治療對病變進展起到一定抑制作用，但平均只能維持1～2年，之后常常因癌細胞出現(xiàn)雄激素非依賴性導致治療失?。?］。近年來，人們在分子水平對雄激素非依賴性PCa的發(fā)病機制和治療進行了大量的研究，不斷尋找新的致癌基因并作為潛在的分子靶，而其中具有PCa組織特異性的致癌基因更有研究價值［8-9］。

在PCa中表達異常的基因PAR位于1號染色體，有1 038個堿基對，編碼146個氨基酸的蛋白質(zhì)，在正常的前列腺組織和癌組織中均有表達，但在大約67%癌組織標本中有更高的表達；PAR在LNCaP、DU145、PC3和LNCaP-OM等PCa細胞系中的表達也比正常的前列腺上皮細胞高；而在雄激素非依賴性細胞系DU145、PC3和LNCaP-OM的表達高于雄激素依賴性細胞系LNCaP。雄激素可以使雄激素依賴性細胞系的PAR表達下調(diào)，對雄激素非依賴性細胞系的PAR表達則無抑制作用［10］。Platica等［3］將PAR cDNA重組于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3成纖維細胞系使其獲得惡性表型。抑制PAR基因在雄激素非依賴性PCa細胞系中的表達，使其惡性表型逆轉(zhuǎn)。

本實驗采用靶向PAR基因siRNA轉(zhuǎn)染PC3細胞，通過抑制PAR基因的表達研究其功能。轉(zhuǎn)染siRNA的PC3細胞系與對照組相比，PAR基因的mRNA表達明顯下調(diào)，提示RNAi技術(shù)可以有效抑制PAR的表達，有望作為PCa基因治療的有效手段。

本研究進一步利用流式細胞術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)PAR基因的mRNA表達下調(diào)能夠明顯引起PC3細胞G2/M期阻滯，凋亡增加。G2/M期檢查點是細胞存活和死亡的重要決定點，細胞經(jīng)過此點即進入分裂期［11-12］。下調(diào)PAR基因的表達抑制腫瘤細胞生長，其主要機制可能是誘導腫瘤細胞G2/M期阻滯和凋亡。

細胞周期進程是通過Cdc25磷酸酶激活細胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)進行調(diào)控。已知Cdc25磷酸酶分3個亞型：Cdc25C、Cdc25B和Cdc25C。

Cdc2/cyclin B是G2/M期轉(zhuǎn)變在G2期檢查點的總開關(guān)，而Cdc25C是Cdc2/cyclin B的主要激活物。Cdc25C磷酸酶活性被抑制將導致Cdc2/cyclin B激活受阻，使細胞周期阻滯于G2/M期［13］。本研究檢測抑制PAR基因表達后Cdc25C磷酸酶表達水平，發(fā)現(xiàn)Cdc25C磷酸酶表達下調(diào)，表明Cdc25C參與了PAR基因表達抑制后導致的PC3細胞G2/M期阻滯。

綜上所述，PAR表達抑制能夠引起PC3細胞G2/M期阻滯，凋亡增加。其機制可能是通過下調(diào)Cdc25C磷酸酶表達，進一步導致Cdc2/cyclin B激活受阻。

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Cdc25C is involved in cell cycle G2/M arrest and apoptosis induced by siRNA targetingPARgene in human prostate cancer PC3 cells

XU Xiao-feng, ZHOU Xiu-min, DONG Jie, ZHANG Zheng-yu, GE Jing-ping, ZHOU Wen-quan，WEI Wu, CHENG Wen, WEI Zhi-feng, HOU Jian-quan,GAO Jian-ping(Department of Urology Surgery, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region,Nanjing Jiangsu 210002, China)

GAO Jian-ping E-mail：gao85680823@126.com

Background and purpose：The expression ofPARgene was higher in androgen-resistant prostate cancer (PCa) in comparison to androgen-sensitive PCa and may be involved in the cellular malignant transformation.This study was designed to investigate the effects of downregulatedPARexpression on the cell cycle of PC3 cells and to explore the role of Cdc25C in this process.Methods：Suppression ofPARexpression was achieved by transfection of PC3 cells with small interfering RNA (siRNA) target against PAR. Phase distribution of cell cycle was analyzed by fl ow cytometry. Western blot was performed to investigate the expression of Cdc25C.Results：The expression of PAR was suppressed by siRNA. Flow cytometry revealed a cell cycle G2/M arrest and induction of apoptosis. Western blot showed the expression of Cdc25C decreased afterPARexpression downregulated.Conclusion：Downregulated PAR expression inhibits the expression of Cdc25C and thus is involved in the G2/M arrest and apoptosis of PC3 cells.

PARgene; Prostate cancer; Cell cycle; Cdc25C

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.01.001

R737.25

A

1007-3639(2012)01-0001-04

國家自然科學基金青年科學基金項目(No:30901716)；南京軍區(qū)南京總醫(yī)院醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金項目(No:2009Q023)。

高建平 E-mail:gao85680823@126.com

2011-08-03

2011-11-07）