高曉明，陳艷玲，劉貫山，李鳳霞，王衛(wèi)峰，任媛媛，孫玉合*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，農(nóng)業(yè)部煙草生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；2.華大基因研究院，深圳 518083）

近年來(lái)，越來(lái)越多物種的全基因組已被測(cè)序。此為重要基因的克隆、系統(tǒng)進(jìn)化和基因組學(xué)研究提供了堅(jiān)實(shí)的平臺(tái)。構(gòu)建細(xì)菌人工染色體文庫(kù)（BAC）是全基因組測(cè)序的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[1-2]。BAC文庫(kù)具有插入片段大、嵌合率低、遺傳穩(wěn)定性好、易于操作等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞。目前已經(jīng)在棉花[3-4]、水稻[5-6]、玉米[7]、大豆[8-9]、高粱[10]、黍[11]和番茄[12]等作物中建立了BAC文庫(kù)，為測(cè)序、基因圖位克隆、分子標(biāo)記、物理作圖、基因結(jié)構(gòu)和調(diào)控等研究提供了一個(gè)重要的技術(shù)平臺(tái)。建立絨毛狀煙草（Nicotiana tomentosiformis）的BAC基因組文庫(kù)，對(duì)煙草基因功能、次級(jí)代謝途徑的研究等均有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試煙草材料為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所基地種植的絨毛狀煙草。BAC克隆載體采用Epicentre公司的 CopyControlTMBAC Cloning Kit(Hind III)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞核 DNA 的制備 -80 ℃冷凍保存的嫩葉50 g，液氮研磨約30 min至粉末狀，加入500 mL預(yù)冷的NIBM（10% TKE，1 mM spermidine，1 mM spermine，0.2%β-巰基乙醇），間歇性輕輕攪拌約15 min。先后用4層紗布和1層miracloth過(guò)濾；濾液中加入 1/40體積的 NIBT（10% TKE，1 mM spermidine，1mM spermine，20% Triton X-100），間歇性輕輕攪拌10 min，4 ℃ 2000 g 離心15 min；棄上清，用 50 mL預(yù)冷的 NIBM 重懸沉淀，兩層miracloth過(guò)濾，4 ℃ 2000 g 離心15 min。重復(fù)該操作5次。棄上清，用1 mL NIB（10% TKE，1 mM spermidine，1mM spermine）重懸沉淀，45 ℃水浴2～5 min，與用NIB配制的，并經(jīng)45 ℃水浴的1.5%低熔點(diǎn)膠等體積混合?；靹蚝筠D(zhuǎn)移至模具中，冰上放置30 min形成plugs。制備好的plugs轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入20 mL lysis buffer [0.5 M EDTA（pH 9.2），1% lauryl sarcosine，過(guò)濾滅菌，加入蛋白酶K至0.3 mg/mL，混勻，50 ℃水浴24 h。倒掉lysis buffer，重新加入新鮮的lysis buffer和蛋白酶K，50 ℃水浴 24 h。倒掉處理液，加入 1×TE（pH8.0），4 ℃冷庫(kù)震蕩30 min。倒掉處理液，加入1×TE（pH 7.6），4 ℃冷庫(kù)震蕩30 min。倒掉處理液，加入含0.2 mM PMSF的10 mL TE緩沖液（pH 7.6），室溫靜置30 min，重復(fù)該操作2次。加入50 mL TE緩沖液（pH 8.0），4 ℃冷庫(kù)震蕩30 min，重復(fù)該操作2次。plugs加入50 mL TE緩沖液（pH 8.0），4 ℃保存或用于酶切。

1.2.2 大片段DNA的獲得 按照1個(gè)plugs在3 mL buffer1（V1×HindⅢ buffer：V1M spermidine：V1M DTT= 3000：6：1）中4 ℃平衡2次，每次30 min的要求，平衡6個(gè)plugs。將每個(gè)plugs分割成等大的12份，將每4小份的plug加入裝有 buffer 2（1×HindⅢ buffer 170 μL；1 M spermidine 0.34 μL；1M DTT 0.17 μL，10 mg/mL BSA2 μL 和1.6 U的HindⅢ）的1.5 mL離心管中，共18管，冰上平衡1.5 h，37 ℃水浴8 min；加入1/10體積的0.5 M EDTA（pH8.0），4 ℃放置30 min；脈沖場(chǎng)電泳進(jìn)行膠回收，電泳分為2個(gè)Block。Block1：起始脈沖時(shí)間90 s，終止脈沖時(shí)間90 s，溫度12.5 ℃，角度120°，電壓6 V/cm，電泳時(shí)間14 h；Block2：起始脈沖時(shí)間5 s，終止脈沖時(shí)間5 s，溫度12.5 ℃，角度120°，電壓4 V/cm，電泳時(shí)間2 h。電泳結(jié)束后切下100～150 kb部分和150～200 kb部分。所得膠條經(jīng)透析后進(jìn)行二次脈沖場(chǎng)凝膠電泳，電泳條件為起始脈沖時(shí)間5 s，終止脈沖時(shí)間5 s，溫度12.5 ℃，角度120°，電壓4 V/cm，電泳時(shí)間14 h。切膠回收，脈沖電泳透析，將透析袋中溶液用于連接。

1.2.3 大片段DNA與BAC載體的連接與轉(zhuǎn)化 連接體系如下：DNA12.5 μL（25 ng），載體 0.75 μL（18.75 ng），純化水8.5 μL，混勻，55 ℃ 10 min，RT 15 min，再加入 10×Ligase Buffer2.5 μL，100 mM ATP0.25 μL，2 U/μL Fast link ligase 0.5 μL，16 ℃連接16 h；連接液中加入0.4 μL 0.5 M EDTA（pH8.0）和 0.4 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K，混勻，37 ℃水浴1 h；加入0.4 μL 100 mM PMSF，混勻，RT 1h；將連接液點(diǎn)在0.025 μm Millipore膜中間，置于含冰冷純化水的平皿中，脫鹽2 h。將2 μL連接產(chǎn)物和20 μL感受態(tài)細(xì)胞EPI 300混勻，電擊轉(zhuǎn)化，吸出轉(zhuǎn)化液，迅速加入900 μL SOC液體培養(yǎng)基，吸打混勻；搖床180 rpm，37 ℃復(fù)蘇60 min。取300 μL復(fù)蘇液均勻的涂布在LB（用前涂100 μL VX-gal：VIPTG= 1：4混合液）上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.4 BAC單克隆插入DNA片段大小的鑒定 隨機(jī)挑取單克隆，分別接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基，200 rmp，37 ℃，震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒DNA，Not I酶切后進(jìn)行脈沖場(chǎng)電泳檢測(cè)，電泳條件為：起始脈沖時(shí)間0.1 s，終止脈沖時(shí)間40 s，溫度14 ℃，角度120°，電壓6 V/cm，電泳時(shí)間14 h。計(jì)算平均插入片段和空載率。

1.2.5 單克隆的挑取與保存 取白斑，接種于含有凍存緩沖液的細(xì)菌培養(yǎng)板中，37 ℃，培養(yǎng)16 h，用鋁箔封好，-80 ℃保存。

2 結(jié) 果

2.1 高質(zhì)量高濃度細(xì)胞核DNA的制備

高效連接的 BAC克隆很大程度上取決于核DNA包埋膠塊plug中核DNA的濃度和純度。由于煙草葉片組織中含有較多的酚類(lèi)等次級(jí)代謝產(chǎn)物，大大降低了細(xì)胞核DNA質(zhì)量，因此本試驗(yàn)選用煙草幼嫩組織為材料來(lái)制備高分子量DNA，幼嫩組織代謝產(chǎn)物少。制備細(xì)胞核 DNA時(shí)按照常規(guī)方法NIBM溶液中β-巰基乙醇的濃度為0.15%，攪拌10 min，制備出的plug顏色為微微的乳黃色，半透明，說(shuō)明仍含有來(lái)自葉片的酚類(lèi)物質(zhì)以及細(xì)胞壁殘?jiān)@些殘留的物質(zhì)會(huì)降低后續(xù)酶切的消化效率。因此試驗(yàn)中將β-巰基乙醇的濃度調(diào)整為0.2%，攪拌15 min，制備出的plug為無(wú)色透明，這說(shuō)明得到的核DNA比較純凈，提高了核DNA的質(zhì)量。

2.2 BAC文庫(kù)的質(zhì)量檢測(cè)

2.2.1 插入片段大小分析 用限制性核酸內(nèi)切酶HindIII，對(duì)包埋的煙草高分子量核DNA進(jìn)行消化，通過(guò)調(diào)節(jié)酶切時(shí)間及酶濃度，就可以獲得長(zhǎng)度適合建庫(kù)的高分子量核 DNA。在進(jìn)行大規(guī)模的酶切之前，先通過(guò)小范圍的酶切試驗(yàn)確定最佳的酶切時(shí)間和酶濃度。隨機(jī)挑取100個(gè)單克隆，提其質(zhì)粒并酶切鑒定插入片段大小。結(jié)果表明：插入片段分布在50～200 kb之間，平均插入片段約為110 kb，空載率＜2%（圖1）。

圖1 插入片段Not I酶切檢測(cè)Fig.1 PFGE analysis of insert size of the randomly picked clones

2.2.2 BAC克隆穩(wěn)定性分析 隨機(jī)挑取15個(gè)BAC單菌落，連續(xù)培養(yǎng)100代；提取第0代和第100代的BAC質(zhì)粒DNA，分別進(jìn)行EcoR?酶切，進(jìn)行脈沖場(chǎng)電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，經(jīng)繼代培養(yǎng)后，BAC克隆的酶切帶形一致（圖2）。說(shuō)明BAC克隆中的插入片段至少可以穩(wěn)定遺傳100代。

圖2 繼代穩(wěn)定性EcoR?酶切檢測(cè)Fig.2 Stability analysis of BAC clones

3 討 論

煙草作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和國(guó)際貿(mào)易中占有重要地位。目前生產(chǎn)上應(yīng)用最普遍、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最大的栽培種普通煙草[Nicotiana tabacum(SSTT，2n=4X=48)]，是由林煙草[N.sylvestris (SS，2n=24) ]和絨毛狀煙草(TT，2n=24)種間雜交形成的一個(gè)不育的雜交種，經(jīng)染色體加倍后形成的可育異源四倍體，進(jìn)化成為現(xiàn)在的商業(yè)化栽培種。絨毛狀煙草是普通煙草的原始親本之一，基因組大小約為 2300 M。在確定絨毛狀煙草的全基因組序列后，可以更加方便地確定其它煙草屬內(nèi)其它種的基因組序列，從而掌握普通煙草及其近緣野生種的完整序列信息。

目前大片段文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)已經(jīng)十分成熟，但是相對(duì)于普通文庫(kù)的構(gòu)建來(lái)說(shuō)，依然存在技術(shù)上的難點(diǎn)。高質(zhì)量高濃度的細(xì)胞核DNA插入片段的制備是 BAC文庫(kù)能否構(gòu)建成功的最基本條件。植物材料的選取直接影響細(xì)胞核的質(zhì)量。本試驗(yàn)所用材料取自田間幼嫩葉片，葉綠體含量低，酚類(lèi)及其它次級(jí)代謝產(chǎn)物含量低，很好地保證了試驗(yàn)所需細(xì)胞核的質(zhì)量。為減少提取過(guò)程中細(xì)胞核的物理?yè)p傷和防止高分子量DNA的物理打斷，植物組織研磨不能太細(xì)，包埋細(xì)胞核的操作及酶切、連接的操作必須動(dòng)作輕柔，使用廣口槍頭。

高分子量的大小均一的插入片段是構(gòu)建 BAC文庫(kù)最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一[13-14]，設(shè)計(jì)一系列小規(guī)模酶切試驗(yàn)以確定最佳酶切時(shí)間和酶濃度是十分重要的。Karutoyo等[15]的研究結(jié)果表明，如果酶用量過(guò)大可能導(dǎo)致非特異性酶切，這種非特異性酶切雖然在整個(gè)酶切反應(yīng)體系中發(fā)生的幾率很小，但結(jié)果卻會(huì)產(chǎn)生很高比例的假陽(yáng)性，從而導(dǎo)致整個(gè)文庫(kù)的空載率過(guò)高。

在連接反應(yīng)中，盡量避免在插入片斷中混有小片段。片段太小建庫(kù)的重復(fù)次數(shù)、克隆保存數(shù)等就會(huì)增加很多。片段太大會(huì)降低連接轉(zhuǎn)化效率。

轉(zhuǎn)化反應(yīng)也是重要步驟之一。整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程越快越好，操作要熟練，動(dòng)作越快轉(zhuǎn)化效率越高。同時(shí)，轉(zhuǎn)化環(huán)境要求低離子強(qiáng)度，故在連接反應(yīng)之后要對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽處理。Allouis等[16]的試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)化條件是影響大片段基因組文庫(kù)插入片段大小的關(guān)鍵因素。BAC載體理論上可以攜帶 300 kb的外源基因片段，但現(xiàn)在所有的 BAC文庫(kù)平均插入片段在150 kb左右，可見(jiàn)優(yōu)化目前的轉(zhuǎn)化條件以提高插入片段的大小是急需解決的問(wèn)題。

本試驗(yàn)成功地構(gòu)建了絨毛煙草 BAC文庫(kù)，為進(jìn)一步克隆重要功能基因提供了必備的物質(zhì)平臺(tái)。

[1]Frary A, Nesbitt T C, Grandillo S, et al.fw2.2: a quantitative trait locus key to the evolution of tomato fruit size[J].Science, 2000, 289: 85-88.

[2]Li X Y, Qian Q, Fu Z M, et al.Control of tillering in rice[J].Nature, 2003, 422: 618-621.

[3]鄭擁民，王省芬，張桂寅，等.高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗病棉花品種中棉所12細(xì)菌人工染色體（BAC）文庫(kù)構(gòu)建[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（3）：17-20.

[4]王省芬，馬駿，馬峙英，等.高纖維強(qiáng)力棉花種質(zhì)系蘇遠(yuǎn) 7235 BAC 文庫(kù)的構(gòu)建[J].棉花學(xué)報(bào)，2006，18（4）：200-203.

[5]Nakamura S, Asakawa S, Ohmido N, et al.Construction of an 800-kb contig in the near-centromeric region of the rice blast resistance gene Pi-ta2 using a highly representative rice BAC library[J].Mol Gen Genet, 1997,254 (6): 611-620.

[6]彭開(kāi)蔓，張洪斌，張啟發(fā).優(yōu)良水稻品種“明恢 63”BAC 文庫(kù)的構(gòu)建[J].植物學(xué)報(bào)，1998，40（12）：1108-1114.

[7]Fu H, Dooner H K.A gene-enriched BAC library for cloning large allele-specific fragments from maize:isolation of a 240-kb contig of the bronze region[J].Genome Res, 2000, 10(6): 866-873.

[8]Danesh D, Peuela S, Mudge J, et al.A bacterial artificial chromosome library for soybean and identification of clones near a major cyst nematode resistance gene[J].Theor Appl Genet, 1998, 96 (2): 196-202.

[9]Salimath S S, Bhattacharyya M K.Generation of a soybean BAC library, and identification of DNA sequences tightly linked to the Rps1-k disease resistance gene[J].Theor Appl Genet, 1999, 98(5): 712-720.

[10]Woo S S, Jiang J, Gill B S, et al.Construction and characterization of a bacterial artificial chromosome library for Sorghum bicolor[J].Nucleic Acids Res, 1994,22(23): 4922-4931.

[11]Tao Q, Zhang H.Cloning and stable maintenance of DNA fragments over 300 kb in Escherichia coli with conventional plasmid-based vectors[J].Nucleic Acids Res, 1998, 26: 4901-4909.

[12]Hamilton C M, Frary A, Xu Y, et al.Construction of tomato genomic DNA libraries in a binary-BAC (BIBAC)vector[J].Plant J, 1999, 18(2): 223-229.

[13]Thorsen J, Zhu B, Frenqen E, et al.A highly redundant BAC library of Atlantic salmon (Salmo salar): an important tool for salmon projects[J].BMC Genomics,2005, 6(1): 50.

[14]Kim U J, Birren B W, Slepak T, et al.Construction and characterization of a human bacterial artificial chromosome library[J].Genomics, 1996, 34: 213-218.

[15]Karutoyo O, Woon P Y, Zhao B, et al.An improved approach for construction of bacterial artificial chromosome libraries[J].Genomics, 1998, 52(1): 1-8.

[16]Allouis S, Qi X, Lindup S, et al.Construction of a BAC library of pearl millet, Pennisetum glaucum[J].Theor Appl Genet, 2001, 102: 1200-1205.