朱忠彬，吳秉奇，丁延芹，陳曉明，張長(zhǎng)華，杜秉海，王玉軍

（1.貴州省煙草公司遵義市公司，貴州 遵義 563000；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東 泰安 271018）

煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，對(duì)我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展起著舉足輕重的作用[1-3]。但自上世紀(jì) 90年代以來，煙草生產(chǎn)中由于過量施用化肥帶來的環(huán)境污染和土質(zhì)下降等問題日益突出[4]。煙草是葉用經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)煙草的外觀和內(nèi)在質(zhì)量有特殊的要求，農(nóng)藥殘留、病原菌抗藥性以及對(duì)卷煙衛(wèi)生的影響，限制了農(nóng)藥的大規(guī)模利用，同時(shí)也不利于煙葉的出口[5]。因此以植物根際促生細(xì)菌（PGPR）為主的微生物制劑成為目前煙草種植中研究的熱點(diǎn)之一。一方面，PGPR能夠改善植物對(duì)礦物質(zhì)元素和水分的吸收、改變植物激素平衡、改善根部環(huán)境，且可以通過產(chǎn)生生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、乙烯、維生素及其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)[6-8]；另一方面，PGPR還可誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性（ISR）[9]，使煙草具有對(duì)多種病害的抵抗能力，在煙草生產(chǎn)中具有十分重要的意義。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種具有促生能力的 PGPR菌株，熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）RB242和 RB289能夠有效促進(jìn)煙草生長(zhǎng)[10]，從印度西部森林分離的Bacillus thioparus NII-0902表現(xiàn)出多種植物的促生活性[11]，Bacillus vallismortis EXTN-1能夠觸發(fā)馬鈴薯等植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，提高馬鈴薯抗病毒PVY和PVX能力，增加葉綠素含量[12]。目前大多數(shù)的報(bào)道局限于PGPR的促生防病效果，其誘導(dǎo)煙草系統(tǒng)抗性及對(duì)煙草生理指標(biāo)的影響等方面的研究仍少見報(bào)道。

本研究在溫室條件下研究PGPR菌株短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）DZQ3對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育的影響，探討其對(duì)煙草系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)作用，旨在為進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用PGPR制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 盆栽試驗(yàn)土壤 取自泰安當(dāng)?shù)剞r(nóng)田，每盆裝土大約10 kg，土壤理化性質(zhì)為：全氮5.47 g/kg，全磷1.01 g/kg，全鉀6.03 g/kg，有機(jī)質(zhì)和腐殖質(zhì)含量分別為8.81 mg/g和2.10 mg/g，速效磷、速效鉀、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量分別為82.26、78.54、5.79和55.31 mg/kg，pH為7.54。

1.1.2 肥料 美康田佳牌復(fù)合肥（山東康田化肥有限公司），總有效成分≥40%，其中N:P:K=20:10:10，按照5 g/盆用量溶解后澆灌于土壤中。

1.1.3 品種 煙草品種為 K326，在育苗基質(zhì)中培育至5～6片真葉，備用。

1.1.4 供試菌種 分離自貴州煙田根際土壤的短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）DZQ3，實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)煙草青枯病病原菌茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）具有強(qiáng)烈的拮抗作用[13]。

1.1.5 培養(yǎng)基 菌株活化采用 LB培養(yǎng)基，DZQ3搖瓶發(fā)酵采用豆芽汁培養(yǎng)基（黃豆芽 200 g，蔗糖20 g，蒸餾水1000 mL）。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 DZQ3活化后 30 ℃、170 r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 3 d，用無菌水稀釋成 1×108CFU/mL。

1.2.2 盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)校本部日光溫室內(nèi)進(jìn)行，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的煙苗，移栽前將煙草幼苗在1×108CFU/mL濃度的DZQ3菌液中浸根30 min，然后將煙苗移栽至盆中。緩苗3 d后用移液槍頭將DZQ3菌懸液（1×108CFU/mL）灌入煙株根際土壤，每株煙4 mL菌液，同時(shí)取1 mL菌液淋于莖基部。對(duì)照采用清水按同樣的方法處理，其余按照溫室常規(guī)管理。5次重復(fù)，每重復(fù)3株煙。

1.2.3 DZQ3促生效果調(diào)查 煙株移栽后30、60、90 d時(shí)調(diào)查農(nóng)藝性狀。種植期結(jié)束后，取出植株用清水洗凈，風(fēng)干后測(cè)定煙株鮮重。將煙株置于烘箱中105 ℃殺青30 min，60 ℃繼續(xù)烘干48 h，取出測(cè)整株干重。

1.2.4 煙草葉片生理指標(biāo)的測(cè)定 煙株移栽后30、60、90 d時(shí)，取從上至下數(shù)第4片展開的葉片，剪碎混合均勻后測(cè)定以下指標(biāo)，3次重復(fù)取平均值。葉綠素含量、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性參照文獻(xiàn)[14]的方法測(cè)定，多酚氧化酶（PPO）活性采用高峻鳳的方法測(cè)定[15]，過氧化氫酶（CAT）采用過氧化氫分解量法測(cè)定[16]，電解質(zhì)相對(duì)滲透率用電導(dǎo)法測(cè)定[16]。

1.2.5 煙草根系發(fā)育情況測(cè)定 生長(zhǎng)期結(jié)束后，移出整個(gè)煙株，用清水洗凈風(fēng)干后稱鮮重，計(jì)算根冠比。根系活力的測(cè)定采用TTC法[17]。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 DZQ3對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育的影響

從圖1可以看出，接種拮抗菌DZQ3的煙株長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于對(duì)照，處理煙株的莖圍、最大葉寬、最大葉面積和對(duì)照間差異較為明顯。移栽30 d后，DZQ3處理的煙株莖圍、最大葉寬、最大葉面積3項(xiàng)指標(biāo)分別比對(duì)照高出 16.79%、15.01%、24.56%，差異顯著；移栽60 d后，DZQ3處理煙株只有莖圍與對(duì)照差異達(dá)顯著水平，比對(duì)照高出16.52%；移栽90 d時(shí)，DZQ3處理煙株莖圍和最大葉寬分別比對(duì)照高出11.34%、24.23%，差異顯著。由此可見，接種拮抗菌DZQ3對(duì)煙草早期的生長(zhǎng)發(fā)育起到明顯的促進(jìn)作用，有利于煙株莖圍增粗和葉面積增大，在煙草旺長(zhǎng)期時(shí)處理間差距不是很明顯，而在后期又表現(xiàn)出一定的差距。同時(shí)可以看出，DZQ3處理煙株的莖圍與對(duì)照間的差距在整個(gè)生長(zhǎng)期均可達(dá)到顯著水平，而DZQ3對(duì)株高、葉數(shù)、最大葉長(zhǎng)三項(xiàng)指標(biāo)的影響不大，雖然各生長(zhǎng)期相比于對(duì)照能夠表現(xiàn)出一定的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，但差異不顯著。

由表1可以看出，DZQ3對(duì)煙草生物量的影響較大，接種拮抗菌的煙株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量相比于對(duì)照均有增大的趨勢(shì)，尤其是煙株鮮質(zhì)量，比對(duì)照增加38.48%，差異顯著，但在干質(zhì)量方面雖然比對(duì)照高出9.55%，差異并不顯著。

2.2 煙草葉片系統(tǒng)抗性相關(guān)生理指標(biāo)

圖1 不同生長(zhǎng)期各處理煙株農(nóng)藝性狀Fig.1 Agronomic traits of tobacco of each treatment in different growth phase

表1 各處理煙株生物量Table1 Biomass of tobacco

表2 拮抗菌對(duì)煙草葉片部分生理指標(biāo)的影響Table2 Effect of antagonism bacterium on physiological index in leaves of tobacco

表2顯示，接種DZQ3的煙草各項(xiàng)生理指標(biāo)要好于對(duì)照，其中在移栽后60 d時(shí)，即旺長(zhǎng)期時(shí)差異最為顯著，此時(shí)處理煙株葉片的葉綠素含量、SOD、PPO、POD、PAL、CAT活性分別比對(duì)照高出17.03%、12.26%、17.49%、30.14%、20.65%和 43.78%，差異均達(dá)到顯著水平；移栽30 d時(shí)，電解質(zhì)相對(duì)滲透率、SOD、PPO、PAL活性與對(duì)照間差異顯著，電解質(zhì)相對(duì)滲透率低于對(duì)照26.35%，SOD、PPO、PAL活性分別比對(duì)照高出13.58%、25.13%和38.97%；移栽90 d時(shí)，只有SOD活性與對(duì)照間差異顯著，高出對(duì)照21.03%?？梢姡珼ZQ3對(duì)煙株系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)主要體現(xiàn)在團(tuán)稞期和旺長(zhǎng)期等中前期生長(zhǎng)階段，煙草葉片防御酶活性相比于對(duì)照有較大提升，增強(qiáng)了植株對(duì)病害的防御力，而在煙草生長(zhǎng)后期差距不是很明顯，只有 SOD活性與對(duì)照間的差距在整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)均可達(dá)到顯著水平。

2.3 煙草根系發(fā)育

表3可見，DZQ3能夠促進(jìn)煙草的根系發(fā)育，煙株根系活力和根部鮮重分別比對(duì)照高出 38.34%和44.91%，差異顯著，根冠比略高于對(duì)照，但差異不顯著。

表3 煙草根系發(fā)育情況Table3 Root position of tobacco

2.4 煙草病害情況

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)過程中DZQ3處理煙株和對(duì)照都不同程度的感染煙草花葉病，但是接種DZQ3的煙株發(fā)病較晚，且發(fā)病率低于對(duì)照。移栽35 d后，對(duì)照煙株開始出現(xiàn)花葉病癥狀，發(fā)病率為6.67%，49 d時(shí)發(fā)病率升至20%，56 d時(shí)達(dá)到33.30%；DZQ3處理煙株56 d時(shí)發(fā)現(xiàn)感染花葉病，發(fā)病率為6.67%，推遲發(fā)病21 d，同時(shí)期發(fā)病率低于對(duì)照26.63%。

3 討 論

短短芽孢桿菌作為植物根際普遍存在的細(xì)菌種屬，其促生作用已經(jīng)有所報(bào)道，例如A57能夠促進(jìn)棉花子葉的展開和幼苗的發(fā)育[18]，DS-1可以提高黃瓜種子的發(fā)芽率，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，并且能夠誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，根際接種短短芽孢桿菌 DZQ3能夠有效的促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)，煙草農(nóng)藝性狀和生物量均好于對(duì)照。尤其是在煙草生長(zhǎng)早期，DZQ3對(duì)煙株莖圍和葉面積的影響較大，有利于煙草在生長(zhǎng)早期吸收利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、增強(qiáng)葉片的光合作用，為其生長(zhǎng)發(fā)育打下良好的基礎(chǔ)。對(duì)煙草根系發(fā)育情況的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，DZQ3能夠促進(jìn)煙草的根部生長(zhǎng)發(fā)育，煙株根系活力和根部鮮質(zhì)量顯著優(yōu)于對(duì)照，這對(duì)地上部分的生長(zhǎng)和煙草的抗病性起到重要作用。

研究表明，生物因子和非生物因子等多種誘導(dǎo)因子可誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性[20-21]。各種誘導(dǎo)因子可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)SOD、POD、CAT、PAL、PPO等防御酶活性的升高以及葉綠素、電解質(zhì)相對(duì)滲透率等生理指標(biāo)的改變。其中SOD、POD和CAT與植物體內(nèi)活性氧的清除密切相關(guān)[22]，PAL和 PPO與植物體內(nèi)酚類代謝和木質(zhì)素的形成有關(guān)，是與系統(tǒng)抗性密切相關(guān)的酶[23]，葉綠素含量是衡量植物光合作用能力的大小重要指標(biāo)，植物受到逆境脅迫時(shí)葉綠素含量會(huì)有所下降，電解質(zhì)相對(duì)滲透率則反映了植物對(duì)病原菌抵抗力的強(qiáng)弱，細(xì)胞電解質(zhì)滲透率小則不易受到病原菌的侵害。Liang等[22]通過分根法在黃瓜根部分別接種生防菌L8和猝倒病病原菌發(fā)現(xiàn)黃瓜根部和葉片中SOD、POD、CAT、PPO和PAL活性均顯著升高，降低了黃瓜幼苗猝倒病的發(fā)病率；Vanitha等[24]研究發(fā)現(xiàn)番茄根際接種熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）增強(qiáng)了番茄對(duì)青枯病的抗性，PPO、PAL等防御酶活性顯著提升，且通過RT-PCR手段發(fā)現(xiàn)相關(guān)酶合成基因的表達(dá)水平顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)煙草根際接種DZQ3后，葉片中幾種防御酶活性和葉綠素含量均顯著高于對(duì)照，電解質(zhì)相對(duì)滲透率比對(duì)照有所降低，移栽60 d時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照間差異最為顯著，此時(shí)也是煙草田間病害的高發(fā)期，同時(shí)溫室試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)接種DZQ3的煙草花葉病發(fā)病率比對(duì)照有所降低，可能是DZQ3誘導(dǎo)煙株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性從而抵御花葉病毒侵害的原因。以上結(jié)果表明生防細(xì)菌DZQ3可誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，增強(qiáng)煙草對(duì)病害的抵抗力。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，PGPR菌株短短芽孢桿菌DZQ3能有效改善煙草生長(zhǎng)期內(nèi)的農(nóng)藝性狀、提高生物量，促進(jìn)葉片防御酶活性的升高及根系發(fā)育水平。因此具有良好的促生作用和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性能力，可以增強(qiáng)煙草植株對(duì)病害的防御力，有利于煙草產(chǎn)量和質(zhì)量的提高。短短芽孢桿菌是土壤中自然存在的細(xì)菌，對(duì)人體、動(dòng)物無致病性，因而具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力，但是關(guān)于DZQ3的促生機(jī)理、定殖能力和田間應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步的研究證明。

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