朱文增，倪金霞，盛國濱，于致順

·基礎(chǔ)研究·

頭穴叢刺法對急性腦梗死大鼠行為學(xué)及凋亡相關(guān)基因bcl-2的影響①

朱文增1，倪金霞2，盛國濱3，于致順3

目的 探討頭穴叢刺對急性腦梗死大鼠神經(jīng)行為學(xué)及凋亡相關(guān)基因bcl-2的影響。方法將72只雄性Wistar大鼠隨機分為3組：假手術(shù)組(A)、造模組(B)和頭穴叢刺組(C)，每組各24只。各組再根據(jù)腦梗死后不同時間分為6 h、24 h和3 d三個亞組，每個時間點各8只。采用線栓法制備急性腦梗死動物模型，觀察不同時間點頭穴叢刺法對急性腦梗死大鼠行為學(xué)及腦組織凋亡相關(guān)基因bcl-2表達(dá)的影響。結(jié)果腦梗死第3天，C組大鼠神經(jīng)功能評分明顯低于B組(P＜0.01)；C組大鼠術(shù)后不同時間點缺血半暗區(qū)bcl-2的表達(dá)增多，24 h時達(dá)到高峰，與B組比較差異均具有高度顯著性差異(P＜0.01)。結(jié)論頭穴叢刺能明顯降低急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能評分，促進(jìn)運動功能恢復(fù)；并可促進(jìn)大鼠缺血半暗區(qū)bcl-2的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。

腦梗死；大鼠；頭穴叢刺；bcl-2；神經(jīng)功能評分

[本文著錄格式]朱文增，倪金霞，盛國濱，等.頭穴叢刺法對急性腦梗死大鼠行為學(xué)及凋亡相關(guān)基因bcl-2的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2012,18(10):927-929.

頭穴叢刺法是于致順教授在總結(jié)多年臨床經(jīng)驗的基礎(chǔ)上提出的一種治療腦病的新方法。本研究通過觀察頭穴叢刺法對腦梗死大鼠行為學(xué)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl-2的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性Wistar大鼠，體重250～300 g，皮毛光滑潤澤，呼吸道通暢，足部皮膚紅潤，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。將72只大鼠隨機分為假手術(shù)組(A)、造模組(B)和頭穴叢刺組(C)，每組24只。各組再分為6 h、24 h、3 d三個時間點，每個時間點各8只。

1.2 主要器械設(shè)備及試劑 華佗牌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠)；JSJ-1組織脫水機(天津航空機電公司)；BMJ-1生物組織包埋機(天津航空機電公司)；LEICA切片機(德國)；ZDJ-1型展片機(天津航空機電公司)；KDJ-1型烤片機(天津航空機電公司)；CH-2型光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；CH型攝影顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；Bcl-2一抗試劑盒(北京中山試劑公司)；二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；多聚甲醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水合氯醛(昆山市石浦年沙助劑廠)。

1.3 模型制備 采用線栓法制備大腦中動脈閉塞(middle cerebralartery occlusion,MCAO)大鼠模型。選用直徑0.20～0.25mm的強力釣魚線，剪成長40mm的栓線，線前端經(jīng)酒精燈處理形成光滑球形，在手術(shù)顯微鏡下觀察其光滑程度，不合格的剔除，合格栓線消毒后放入生理鹽水中備用。室溫條件下，大鼠稱重后，用10%水合氯醛3.5m l/kg腹腔麻醉后，仰臥固定在手術(shù)臺上，頸部備皮，常規(guī)消毒后行正中切口，鈍性分離并結(jié)扎左側(cè)頸外動脈(ECA)和頸總動脈(CCA)近心端，并于CCA遠(yuǎn)心端備線并打一活結(jié)，鈍性分離頸內(nèi)動脈(ICA)，在ICA遠(yuǎn)心端用微動脈夾夾閉，在CCA分叉部切一小口，將與體重相應(yīng)直徑的栓線插入，收緊備線，打開動脈夾，栓線進(jìn)入ICA，輕柔推進(jìn)，至有阻力不能再進(jìn)即停止推送，此時釣魚線頭端已達(dá)大腦中動脈開口處，進(jìn)線長度為17～21mm(距分叉處)，扎緊備線，縫合，切口局部撒消炎粉。假手術(shù)組只分離動脈，不結(jié)扎、不插線。模型成功的標(biāo)志是[1]：左側(cè)Horner征(+)，右前肢癱瘓，大鼠麻醉清醒后提尾懸空時右側(cè)前肢內(nèi)收、屈曲，自主運動時身體向右側(cè)轉(zhuǎn)圈。不合格的動物剔除。

1.4 操作方法 假手術(shù)組大鼠術(shù)后置于普通籠中飼養(yǎng)；造模組術(shù)后另置普通籠中飼養(yǎng)，不予以任何治療；頭穴叢刺組大鼠術(shù)后6 h即進(jìn)行頭針治療，采用叢刺法，取百會穴及百會左、右側(cè)各旁開4mm處針刺，快速捻轉(zhuǎn)1min后留針30m in，每個觀測時間點針刺1次。對各組大鼠術(shù)后6 h、24 h、3 d進(jìn)行神經(jīng)功能評定后，均開胸暴露心臟，先后用0.85%鹽水及福爾馬林溶液各100m l心臟灌注，以將大鼠體內(nèi)血液沖凈(從右房流出的液體變清)為宜，然后斷頭取腦，將腦組織放入福爾馬林溶液中固定，以備免疫組織化學(xué)檢測。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 行為學(xué)評估 神經(jīng)功能評定按Bederson等[2]制定的標(biāo)準(zhǔn)評分，評分分為4級。0級(分)：未見行為缺陷；1級(分)：前肢屈曲；2級(分)：側(cè)推抵抗力下降(即側(cè)向推力實驗陽性)伴前肢屈曲，無轉(zhuǎn)圈行為；3級(分)：同2級行為伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)。

1.5.2 免疫組化染色程序 二甲苯脫蠟、酒精脫苯，PBS沖洗2min×3次，水化組織切片；3%H2O2去離子水孵育10m in，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；枸櫞酸鈉高壓修復(fù)2min，PBS沖洗2m in×3次；滴加一抗置入4℃冰箱過夜，PBS沖洗2m in×3次；滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育20m in，PBS沖洗2 m in×3次；DAB顯色；自來水充分沖洗；1%蘇木素復(fù)染，自來水沖洗5m in；梯度酒精脫水，二甲苯透明；封片劑封片。

結(jié)果判定：每張切片不同部位在顯微鏡的目鏡下選4個視野，觀察bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)目，取其平均值。bcl-2神經(jīng)元胞漿呈棕黃色染色為陽性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。組間均數(shù)比較采用q檢驗，以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分 模型組在3 d時神經(jīng)功能評分與6 h評分比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，頭穴叢刺組在3 d時神經(jīng)功能評分明顯減少，與6 h、24 h比較(P＜0.05，P＜0.01)。與假手術(shù)組比較，模型組、頭穴叢刺組大鼠造模后不同時間點神經(jīng)功能評分有顯著性差異(P＜0.05)；與模型組比較，頭穴叢刺組大鼠在治療3 d后神經(jīng)功能評分明顯低于模型組(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能評分比較

2.2 bcl-2表達(dá) 模型組術(shù)后不同時間點在缺血半暗區(qū)bcl-2均有不同程度的表達(dá)增多，24 h時達(dá)到高峰，均高于組內(nèi)其它時間點(P＜0.05)。頭穴叢刺組bcl-2亦在24 h時表達(dá)最明顯。模型組和頭穴叢刺組與假手術(shù)組在6 h、24 h、3 d時間點比較，均有高度顯著性差異(P＜0.01)；頭穴叢刺組在6 h、24 h、3 d時間點與模型組比較，bcl-2表達(dá)均明顯增高(P＜0.01)。見表2。

表2 不同時間點各組大鼠缺血半暗區(qū)bcl-2表達(dá)的比較(陽性細(xì)胞數(shù))

3 討論

3.1 頭穴叢刺法對大鼠MCAO后行為學(xué)的影響 神經(jīng)功能評估反映缺血性腦損傷的程度，而且與皮層缺血壞死神經(jīng)元的數(shù)目密切相關(guān)。本實驗采用Bederson神經(jīng)功能評分對比觀察各組大鼠MCAO術(shù)后不同時間神經(jīng)行為的改變。結(jié)果顯示，組內(nèi)比較，模型組在6 h、24 h時神經(jīng)功能評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但在3 d時神經(jīng)功能評分低于6 h評分組(P＜0.05)，可見隨著缺血時間的延長，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損在一定程度上存在自發(fā)性的恢復(fù)過程；頭穴叢刺組3 d神經(jīng)功能評分明顯低于6 h針刺組和24 h針刺組(P＜0.05，P＜0.01)。與模型組比較，頭穴叢刺組在術(shù)后6 h、24 h比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，這可能與大鼠MCAO術(shù)后腦水腫程度較重有關(guān)，而頭穴叢刺治療3 d后，神經(jīng)功能評分減少明顯低于模型組(P＜0.01)，該結(jié)果在一定程度上反映針刺量的累積直接影響腦梗死的治療療效，早期進(jìn)行頭穴叢刺治療能明顯改善大鼠的神經(jīng)功能評分，方法簡單，療效確切。其針刺效應(yīng)的發(fā)揮可能為：通過叢刺頭部穴區(qū)，改變腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的興奮性，糾正抑制性泛化，使可逆性神經(jīng)細(xì)胞復(fù)活或被抑制的神經(jīng)細(xì)胞覺醒，從而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

3.2 抑凋亡基因bcl-2與腦梗死 bcl-2是一種重要的抑制神經(jīng)元凋亡蛋白，可以通過與促凋亡蛋白形成異源二聚體從而達(dá)到抑制凋亡的目的，在維持神經(jīng)細(xì)胞存活方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腦缺血后bcl-2的過量表達(dá)可抑制由于谷氨酸釋放、血清及生長因子缺乏、膜過氧化和自由基等刺激誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)細(xì)胞死亡。bcl-2基因治療對缺血性腦梗死有明顯治療作用，是保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞在遭受致命損傷后免于死亡的一種積極生存機制。在大鼠局灶腦缺血模型中，bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)水平隨缺血時間及再灌流時間呈動態(tài)變化。蔣氏等發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注的早期梗死灶周邊即有bcl-2蛋白開始表達(dá)，3～6 h達(dá)到高峰，24 h開始逐漸降低[3]。馮氏等研究表明，腦缺血2 h再灌注2 h后bcl-2表達(dá)升高，6 h達(dá)到高峰，12 h開始下降，隨著腦缺血再灌注時間延長腦損傷加重，bcl-2蛋白表達(dá)減少[4]。于氏等報道，大鼠全腦缺血再灌注損傷后bcl-2表達(dá)至再灌注12 h達(dá)高峰，再灌注24～72 h逐漸減弱[5]。張氏等觀察到，腦缺血再灌注早期bcl-2蛋白即有表達(dá)，再灌注24 h達(dá)高峰后逐漸降低[6]。陳氏等在觀察腦缺血預(yù)處理對bcl-2表達(dá)的影響時發(fā)現(xiàn)，大鼠皮質(zhì)和紋狀體缺血區(qū)域bcl-2表達(dá)于缺血預(yù)處理再灌注1 d時明顯增加，再灌注3 d時達(dá)高峰，以后逐漸下降，第7天仍高于空白對照組水平[7]。

本研究結(jié)果顯示，大鼠MCAO后不同時間點在缺血半暗區(qū)bcl-2均有不同程度的表達(dá)增多，24 h達(dá)到高峰，隨后bcl-2表達(dá)下降。腦缺血后bcl-2峰值出現(xiàn)時間的差異可能與動物模型建立的方法不同有關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血后不同時間Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)水平發(fā)生變化，認(rèn)為Bcl-2/Bax的比例失衡可能是大鼠腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機制之一[8-10]。關(guān)于針刺對腦缺血大鼠凋亡相關(guān)基因的影響，學(xué)者們有不同的體會。如針刺百會、大椎穴可上調(diào)腦缺血再灌注大鼠腦組織海馬區(qū)bcl-2蛋白的表達(dá)、下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，減輕腦損害[11]；早期針刺足三里、外關(guān)穴，可使急性腦梗死大鼠梗死灶周圍組織中bcl-2的表達(dá)增高，Bax表達(dá)下降，從而保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞[12]；大鼠局灶性腦缺血后6 h、24 h、48 h、72 h不同時間點，電針百會、曲鬢、前頂穴均可使半暗帶Bcl-2蛋白的表達(dá)增多，而6 h、24 h、48 h時間點，Bax蛋白的表達(dá)減少，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[13]；另有研究報道，不同的針刺方法也可促進(jìn)腦梗死大鼠缺血半暗區(qū)bcl-2的表達(dá)[14-16]，抑制促凋亡因子Bax的表達(dá)[16-17]，使Bcl-2/Bax相對升高，從而減輕腦缺血時神經(jīng)功能障礙。

本研究結(jié)果顯示，頭穴叢刺可通過促進(jìn)MCAO大鼠缺血半暗區(qū)bcl-2的表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，挽救缺血半暗區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的功能，從而降低腦梗死后的致殘率，為該方法在臨床的推廣應(yīng)用提供了實驗證據(jù)。

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Effects of Cluster Scalp Acupuncture on Behavior and Apoptosis-related Gene bcl-2 in Rats after Acute Cerebral Infarction

ZHU Wen-zeng,NIJin-xia,SHENGGuo-bin,etal.Guang'anmen Hospital,China Academy ofChineseMedicine Sciences,Beijing 100053,China

ObjectiveTo explore the effects of cluster scalp acupuncture on the behaviorand expression of bcl-2 in rats after acute cerebral infarction.M ethods72maleWistar ratswere random ly divided into sham operation group(A),modelgroup(B)and cluster scalp acupuncture group(C),24 rats in each group.According to time after cerebral infarction,each group was reassigned to 6 h,24 h and 3 d subgroups,8 rats in each subgroup.The acute cerebral infarctionmodelwasestablished w ith themiddle cerebralartery occlusion.The effectsof cluster scalp acupuncture on the behaviorand expression of apoptosis-related genebcl-2 in the ratbrain tissuesw ith acute cerebral infarction were tested atdifferent time.Results3 d after cerebral infarction,the score of neuronal function in group Cwas significantly lower than that of group B(P＜0.01).The expression of bcl-2 in brain ischem ic penumbra increased in group C atdifferent time and reached its peak at24 h. Compared w ith group B,therewas a statistical difference(P＜0.01).ConclusionCluster scalp acupuncture can significantly reduce the neuronal function score of ratsafter acute cerebral infarction and then promote the recovery ofmovement function.The therapy can inhibit the apoptosisby increasing theexpression of bcl-2 in penumbra zoneof cerebral infarction.

acute cerebral infarction;rats;cluster scalp acupuncture;bcl-2;neuronal function score

R743.3

A

1006-9771(2012)10-0927-03

2012-08-17

2012-08-28)

1.黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(11511373)；2.哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項資金項目(2007RFQXS109)。

1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院針灸科，北京市100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京市100700；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院，黑龍江哈爾濱市150001。朱文增(1971-)，男，安徽碭山縣人，中西醫(yī)結(jié)合博士后，副主任醫(yī)師，主要研究方向：針刺對中風(fēng)可塑性影響的研究。通訊作者：倪金霞。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.10.009