謝少華，楊拯，龔都，張堯，余婷，高建華，楊海燕，李曉，馬延仃，張曉

原花青素對脊髓損傷大鼠運動功能的影響①

謝少華，楊拯，龔都，張堯，余婷，高建華，楊海燕，李曉，馬延仃，張曉

目的 觀察原花青素對脊髓損傷大鼠運動功能恢復的影響。方法健康成年SD大鼠36只，采用A llen法(250 g·mm)在T9復制急性脊髓損傷模型，分為A、B、C 3組，每組12只。造模型成功后30m in，A組腹腔注射原花青素40mg/kg，B組腹腔注射甲基強的松龍30mg/kg，C組腹腔注射等體積生理鹽水。于術后1 d、3 d、7 d對各組進行后肢功能BBB評分、斜板試驗，血清丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)測定。結果BBB評分和斜板試驗結果均顯示，術后3 d和7 d，A、B兩組較C組后肢運動功能恢復更好(P＜0.05)。與C組相比，A、B兩組術后1 d和3 d SOD活性升高，MDA含量降低(均P＜0.05)；7 d時，A組較C組SOD活性增高，MDA降低(P＜0.05)。結論原花青素可有效抑制脂質過氧化反應，對脊髓損傷大鼠運動功能的恢復具有促進作用。

原花青素；脊髓損傷；運動功能；超氧化物歧化酶；丙二醛

[本文著錄格式]謝少華，楊拯，龔都，等.原花青素對脊髓損傷大鼠運動功能的影響[J].中國康復理論與實踐,2012,18(9): 831-833.

脊髓損傷發(fā)病率逐年上升，但治療仍是醫(yī)學難題之一。研究顯示，繼發(fā)性脊髓損傷是多種神經生化機制及微血管機制相互級聯(lián)、不斷惡化的過程，如自由基損傷、脂質過氧化反應和炎癥反應等。其中自由基和脂質過氧化反應對損傷部位細胞膜和血管內壁等造成損傷。原花青素(Proanthocyanidin,PC)是中草藥及植物中廣泛存在的一類多酚化合物的總稱，由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結合而成，屬生物類黃酮。原花青素是目前為止抗氧化能力最強的天然提取物之一，體內抗氧化、清除自由基的能力很強[1]。本文研究原花青素對脊髓損傷大鼠運動功能恢復的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 清潔級健康成年Sprague-Dawley大鼠36只，雌雄不拘，體重(200±20)g，由四川大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK (川)-10-2006。將36只大鼠按A llen法造成急性脊髓損傷動物模型后，分為原花青素治療組(A組)、甲基強的松龍治療組(B組)、對照組(C組)，每組12只。每組再分為1 d、3 d、7 d 3個亞組，每個亞組4只。

1.2 主要試劑和儀器 原花青素：四川省維克奇生物科技有限公司，批號：110630；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉：天津藥業(yè)焦作有限公司，批號：10031501；注射用青霉素鈉：瑞陽制藥有限公司，批號：10013101；戊巴比妥鈉(德國進口分裝)：北京化學試劑公司，批號：100808；氯化鈉注射液：安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司，批號：110120 2E；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：20111217；丙二醛(MDA)試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：20111217；TGL-16G臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；721E型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。自制數(shù)字式脊髓損傷動物模型制備儀。

1.3 模型制備 大鼠術前常規(guī)行行為學測試，確認其運動功能正常后，用1.5%戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉。大鼠俯臥固定于手術臺上，背部去毛，碘伏常規(guī)消毒。沿正中線切開大鼠背部皮膚，顯露椎板及棘突。明確T9位置后，沿緊靠棘突的兩邊切開背部肌肉，小心去除T9椎骨上的肌肉，去除椎板，用有齒鑷剝離T9棘突和椎間軟組織，再用無齒鑷剝開錐板，暴露脊髓，并適當修剪兩側錐板以獲得良好顯露。用自制數(shù)字式脊髓損傷動物模型制備儀打擊制備脊髓損傷模型(A llen法)，打擊強度為10 g×25mm。打擊后即刻見大鼠雙后肢發(fā)生不同程度抽搐，尾部甩動，隨后完全松弛，標志模型制備成功。逐層縫合切口。立即腹腔注射0.9%氯化鈉注射液9m l/kg補液。術后每天腹腔注射8×104U青霉素鈉3 d以防感染。待動物清醒后放回飼養(yǎng)籠中單籠飼養(yǎng)。術后大鼠自由進食、飲水，定時清潔籠具，保持適宜室溫；每天擠壓膀胱排尿3次，直至大鼠能自主排尿。

1.4 治療方法 A組：造模成功后30m in腹腔注射原花青素40mg/kg，此后每天注射1次；B組：造模成功后30m in腹腔注射MP 30mg/kg，此后以5.4mg/kg· h每6 h注射1次，共4次；C組：造模成功后腹腔注射等體積生理鹽水。

1.5 評定方法 各組動物按1 d、3 d和7 d亞組進行評定，內容如下。

1.5.1 BBB評分[2]大鼠置寬大活動場地，采用雙人盲法觀察其后肢運動情況，聯(lián)合考察大鼠后肢的運動，軀干的位置及穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調性、爪的置放、足趾間隙及尾的位置。取左右兩側評分的平均值作為最后評分。

1.5.2 斜板試驗[3]大鼠置自制斜板上，墊一橡膠墊，將大鼠身體縱軸與斜板縱軸平行，大鼠頭朝斜板抬高側，斜板傾斜角度從0°開始緩慢上升。記錄大鼠停留在斜板上維持至少5 s時的最大角度，每次測試3遍，取平均值。采用雙人盲法。

1.5.3 血清中MDA和SOD測定 行為學測試完成后，大鼠經右心室取血3m l，3000 r/m in離心15m in，取上清液，-20℃冰箱保存。用SOD和MDA測定試劑盒測定，按試劑盒說明操作。

2 結果

2.1 一般情況 大鼠蘇醒后靜臥少動，氣息較微，雙后肢感覺遲鈍、運動功能喪失，肌張力降為0，無食欲，不進水，尿失禁或下腹部膨隆(尿潴留)。術后3 d，大鼠活動較少，進食少，尿潴留比較嚴重，部分伴血尿及腹部脹氣。此后飲食逐漸增加，活動增多。經過人工按摩膀胱5～7 d后，所有大鼠基本能夠自主排尿。所有大鼠傷口未見感染，未出現(xiàn)壓瘡；少數(shù)大鼠出現(xiàn)后肢水腫。實驗期間A組大鼠死亡2只，B組死亡1只，C組死亡1只，死亡原因不詳，推測可能與嚴重血尿、膀胱破裂、嚴重腹水及多臟器衰竭有關。及時補充同批次動物，使每組實驗動物保持一致。

2.2 BBB評分 術前所有大鼠評分均為21分。術后1 d，A組評分與C組無顯著性差異。術后3 d、7 d，A、B組與C組相比均恢復較好(P＜0.05)。見表1。

表1 各大鼠BBB評分結果

2.3 斜板試驗 術后1 d，A組與C組無顯著性差異。術后3 d、7 d，A、B組與C組相比均恢復較好(P＜0.05)。見表2。

表2 各大鼠斜板試驗結果

2.4 SOD 術后1 d、3 d，A、B兩組SOD活性較C組升高(P＜0.05)。術后7 d，A組SOD活性高于C組(P＜0.05)。見表3。

表3 各組SOD活性(U/m l)

2.5 MDA 術后1 d和3 d，A、B兩組MDA低于C組(P＜0.05)。術后7 d，A組MDA低于C組(P＜0.05)。見表4。

表4 各組MDA含量(nmol/m l)

3 討論

脊髓損傷后自由基介導的脂質過氧化反應是繼發(fā)性損傷的主要因素之一[4]。脊髓損傷后產生大量的氧自由基[5]，脊髓中MDA含量明顯增加[5-6]。SOD是一種重要的自由基清除劑，SOD活性反映內源性氧自由基清除系統(tǒng)的功能[7]。

原花青素屬生物類黃酮，大量的活性酚羥基使它具有較強的抗氧化活性和清除各種活性氧自由基的能力，且易于穿過血-腦屏障。葡萄籽中原青花素在體內的抗氧化、清除自由基的能力是維生素E的50倍、維生素C的20倍[1]；原花青素體外對培養(yǎng)細胞中超氧化陰離子和羥基自由基的抑制能力遠高于維生素C和維生素E[8]；在體外不同反應體系中總體表現(xiàn)出較強抗氧化活性，并對H2O2誘導的細胞氧化損傷具有一定的保護作用[9]。Koga等發(fā)現(xiàn)，原花青素可以提高大鼠血漿對氧化應激的抵抗能力[10]。邢雁霞等給予小鼠原花青素后，小鼠血清MDA下降、SOD活性提高，小鼠的抗疲勞和抗耐缺氧能力得到提高[11]。

隨著研究的深入，原花青素更多的作用被發(fā)現(xiàn)。原花青素可有效防止細胞膜中維生素E損失，顯著減少膜脂質過氧化，是維生素E的生理再生劑，并能與維生素E協(xié)同增強細胞內抗氧化防御系統(tǒng)[12]。原花青素在各種疾病中的研究也進展迅速。Sato等發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素可以增強神經系統(tǒng)的穩(wěn)定性，減少缺血-再灌注所造成的腦損傷[13]。近來國內學者發(fā)現(xiàn)，原花青素對腦缺血再灌注損傷[14]、阿爾茨海默病[15]等神經性疾病具有一定的保護作用，且均與體內抗氧化和自由基清除能力的提高有關。實驗研究顯示，原花青素還能通過調節(jié)Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達，降低腦神經細胞凋亡，從而對腦神經進行保護。

本實驗結果顯示，原花青素能有效提高大鼠體內SOD活性，減少自由基生成。SOD是機體防護自由基損傷的第一道防線[16]，自由基的減少與神經功能恢復呈正相關[17]，兩者直接影響運動功能的恢復。

原花青素作為一種毒性低、安全性高的天然提取物，已經被廣泛用于保健品和化妝品中，但其在疾病預防和治療方面還有待深入研究。原花青素具有很強的抗氧化和清除自由基的能力，這使得它在藥物研發(fā)上有良好前景，但要用于脊髓損傷的臨床治療還需要更為嚴格和深入的研究。本實驗結果表明，原花青素可通過抑制脂質過氧化和清除體內過多的自由基發(fā)揮其治療作用，對脊髓損傷大鼠運動功能的恢復有促進作用。但實驗過程中也發(fā)現(xiàn)，原花青素腹腔注射有一定刺激性，表現(xiàn)為注射后大鼠活動減少。這與雷潔瓊研究所發(fā)現(xiàn)的一樣[18]。因此關于原花青素的最佳給藥方式還需進一步進行研究。此外，原花青素對脊髓損傷的治療效果是否呈劑量依賴也不清楚，還需更全面的研究來探索最佳劑量。

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Effect of Proanthocyanidin on M otor after Spinal Cord In jury in Rats

XIE Shao-hua,YANG Zheng,GONG Du,etal.Chengdu Medical College,Chengdu 610081,Sichuan,China

Ob jectiveTo observe the effect of Proanthocyanidin on motor after spinal cord injury(SCI)in rats.M ethods36 healthy adult SD ratswere divided into groups A,B and C(n=12),and SCIwas induced w ith A llen'smode(250 g·mm)on T9.Proanthocyanidin 40 mg/kg was injected intraperitoneally for group A,methylprednisolone(MP)30mg/kg for group B and the same volume of saline for group C 30m in after SCI.1 d,3 d and 7 d after operation,all the ratswere assessed w ith Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)scale and slanting board test,and their serumalmalondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)were detected.Resu ltsThe scores of BBB and the slanting board test im porovedmore in group A and group B than in group C(P＜0.05).The SOD increased and MDA decreased in groups A and B significantly 1 d and 3 d after operation com pared w ith those of group C(P＜0.05),and only in group A 7 d after operation(P＜0.05).Conclusion Proanthocyanidinmay inhibit the lipid peroxidation and promote the recovery ofmotor after spinal cord injury in rats.

Proanthocyanidin;spinal cord injury;motor;superoxide dismutase;malondialdehyde

R651.2

A

1006-9771(2012)09-0831-03

2012-03-02)

成都醫(yī)學院創(chuàng)新性實驗項目資助(CX 201219)。

成都醫(yī)學院，四川成都市610081。作者簡介：謝少華(1990-)，男，河南安陽市人，本科生。通訊作者：楊拯。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.09.011