劉艷秋，張可華，王運(yùn)良，舒峻，來(lái)薛，吳立群，曹善霞，李鴻，徐揚(yáng)，高艷，崔曉惠，左和鳴，蔡哲

CCK-8和M TS法檢測(cè)人羊膜上皮細(xì)胞增殖的比較①

劉艷秋1a,2，張可華1a，王運(yùn)良2，舒峻1a，來(lái)薛1a，吳立群1b，曹善霞1b，李鴻1a，徐揚(yáng)1b，高艷1b，崔曉惠1b，左和鳴1a，蔡哲1a

目的 探討CCK-8、MTS兩種不同的四唑鹽試劑在羊膜上皮細(xì)胞增殖檢測(cè)中的最適實(shí)驗(yàn)條件，并比較兩者細(xì)胞毒性。方法取體外培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期羊膜上皮細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%胎牛血清)配制成不同濃度的細(xì)胞懸液加入96孔板中培養(yǎng)24 h，分別加入CCK-8、MTS后于450 nm、492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度(OD)。在同一細(xì)胞濃度下，根據(jù)同一波長(zhǎng)不同時(shí)間檢測(cè)的OD確定CCK-8的最佳孵育時(shí)間。取體外培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期羊膜上皮細(xì)胞分別用DMSO、CCK-8、MTS處理1 h、2 h、3 h和4 h后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在450 nm處以CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖，并通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。結(jié)果CCK-8法的最佳波長(zhǎng)為450 nm，MTS法的最佳波長(zhǎng)為492 nm。CCK-8法靈敏度稍低于MTS法。1～4 h內(nèi)，CCK-8試劑與待檢測(cè)細(xì)胞最佳孵育時(shí)間為4 h。CCK-8法對(duì)細(xì)胞增殖影響及細(xì)胞毒性均小于MTS法。結(jié)論CCK-8法是一種更為方便、細(xì)胞毒性作用較小的試劑。

MTS；CCK-8；羊膜上皮細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞毒性

[本文著錄格式]劉艷秋，張可華，王運(yùn)良，等.CCK-8和MTS法檢測(cè)人羊膜上皮細(xì)胞增殖的比較[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐, 2012,18(9):827-830.

人羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cells, hAECs)是胎盤(pán)羊膜組織靠近胎兒側(cè)的單層上皮細(xì)胞，來(lái)源于胚外外胚層。研究表明，hAECs內(nèi)含多種干細(xì)胞樣細(xì)胞和前體細(xì)胞，具有明顯的可塑性和多分化潛能[1]。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，hAECs具有神經(jīng)干細(xì)胞樣特征，并且部分hAECs具有成熟多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的標(biāo)志蛋白和分泌多巴胺的特性。hAECs無(wú)致瘤性，低免疫原性，系產(chǎn)后廢棄物，不涉及社會(huì)倫理學(xué)和生命倫理學(xué)問(wèn)題?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，hAECs成為細(xì)胞移植治療神經(jīng)退行性疾病以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的潛在候選細(xì)胞。

從羊膜分離的hAECs可在體外進(jìn)行傳代培養(yǎng)，最多可傳代至6代以上。隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞的增殖活性隨之下降[1]。另外，不同培養(yǎng)條件對(duì)hAECs增殖也影響甚大。臨床細(xì)胞移植需要建立穩(wěn)定可信的hAECs增殖活性檢測(cè)方法，因此實(shí)驗(yàn)中常常需要hAECs的增殖檢測(cè)。自1983年M osmann建立MTT比色法[3]以來(lái)，由于其經(jīng)濟(jì)、無(wú)放射性污染等特點(diǎn)，被大多數(shù)研究者用于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及活性的檢測(cè)[4-5]。但其在操作過(guò)程中需加入二甲基亞砜(DMSO)溶解甲臜顆粒，且往往溶解不全而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。近年來(lái)，國(guó)外研發(fā)出兩種新型的檢測(cè)方法：CCK-8法和MTS法[6-7]，其原理為活細(xì)胞線(xiàn)粒體脫氫酶轉(zhuǎn)化的黃色結(jié)晶為高度水溶性，不需要裂解細(xì)胞，可直接進(jìn)行比色[8]。兩種方法步驟簡(jiǎn)便，且準(zhǔn)確性得到提高。由于hAECs屬于原代細(xì)胞，與大多數(shù)建系細(xì)胞株代謝特點(diǎn)和增殖活性有所不同，因此在檢測(cè)增殖時(shí)需要對(duì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件和參數(shù)進(jìn)行有針對(duì)性的優(yōu)化。

圖1 在波長(zhǎng)450 nm下細(xì)胞濃度與OD的關(guān)系

圖2 在波長(zhǎng)492 nm下細(xì)胞濃度與OD的關(guān)系

圖3 在敏感波長(zhǎng)下CCK-8和M TS法OD比較

圖4 CCK-8不同孵育時(shí)間下OD比較

圖5 不同試劑下細(xì)胞OD(用CCK-8測(cè)定)

圖6 不同試劑下細(xì)胞形態(tài)(臺(tái)盼藍(lán)染色，40×)

1 材料與方法

1.1 材料 CCK-8試劑：日本同仁化學(xué)公司；MTS試劑：PROMEGA公司；DMSO試劑：GIBCO公司；0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色：GIBCO公司；96孔板：COSTAR公司；MK 3型酶標(biāo)儀：上海雷勃分析儀器有限公司；倒置顯微鏡：OLYMPUS公司；hAECs：中日友好醫(yī)院臨床研究所免疫室傳代保存。

1.2 方法

1.2.1 最佳波長(zhǎng) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期hAECs以每孔不同的細(xì)胞數(shù)(1×103、2×103、5×103、10×103)接種于96孔培養(yǎng)板中，平行接種2組，設(shè)3個(gè)復(fù)孔；每孔加完全培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%胎牛血清)100μl。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔換成DMEM/F12培養(yǎng)基100μl，一組每孔加入CCK-8試劑10μl，另一組每孔加入MTS試劑20μl，培養(yǎng)箱中孵育4 h。兩組分別在波長(zhǎng)450 nm和492 nm下，用酶標(biāo)儀檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的光密度(OD)。

1.2.2 靈敏度 前組細(xì)胞中，加入CCK-8的在450 nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)吸光度，加入MTS試劑的在492 nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)吸光度，比較細(xì)胞數(shù)目不同時(shí)兩種檢測(cè)方法檢測(cè)的OD。

1.2.3 CCK-8共同孵育時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hAECs以每孔5×103接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔完全培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%胎牛血清)100μl。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；每孔換成DMEM/F12培養(yǎng)基100μl，分別加入CCK-8試劑10μl，再孵育1～4 h。450 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀分別檢測(cè)共同孵育1 h、2 h、4 h時(shí)OD。

1.2.4 細(xì)胞毒性 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hAECs以每孔5×103接種于96孔培養(yǎng)板中，平行接種10組，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔完全培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%胎牛血清)100μl。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，換成DMEM/ F12培養(yǎng)基100μl。陰性對(duì)照組不加任何試劑，陽(yáng)性對(duì)照組加入DMSO試劑10μl，另外兩組分別加入CCK-8試劑10μl、MTS試劑20μl，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h、2 h、3 h和4 h后，換成新鮮DMEM/F12培養(yǎng)液100μl，繼續(xù)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入CCK-8 10μl，放置4 h后酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下分別檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖狀態(tài)。每孔培養(yǎng)液換成PBS 100μl，加入0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色試劑5 μl，室溫放置5m in，倒置顯微鏡下觀(guān)察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Student-t檢驗(yàn)，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 最佳波長(zhǎng) 在細(xì)胞孵育時(shí)間相同的條件下，加入CCK-8與加入MTS的細(xì)胞OD都隨著細(xì)胞數(shù)的增加而增加。CCK-8在波長(zhǎng)450 nm處隨細(xì)胞數(shù)增加，OD上升幅度更大，而MTS在波長(zhǎng)492 nm處上升幅度更大(圖1、圖2)。CCK-8敏感波長(zhǎng)為450 nm，MTS為492 nm。

2.2 靈敏度 在CCK-8和MTS各自敏感波長(zhǎng)下檢測(cè)，隨著培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量的增加，OD均增加，相同細(xì)胞濃度下，MTS測(cè)量到的OD均略高于CCK-8(圖3)。

2.3 CCK-8與hAECs最佳共同孵育時(shí)間 CCK-8與培養(yǎng)細(xì)胞共同孵育，隨時(shí)間延長(zhǎng)，OD逐漸增加(P＜0.001)(圖4)。

2.4 細(xì)胞毒性 在波長(zhǎng)450 nm處，DMSO組OD低于陰性對(duì)照組(P＜0.05)，CCK-8組各時(shí)間點(diǎn)與陰性對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，MTS組2 h、3 h時(shí)OD呈明顯下降趨勢(shì)，且各時(shí)間點(diǎn)OD均低于陰性對(duì)照組(圖5)。

臺(tái)盼藍(lán)染色觀(guān)察，DMSO組細(xì)胞收縮變小，均發(fā)生藍(lán)染；MTS組部分細(xì)胞收縮并藍(lán)染；CCK-8組和陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)相似，無(wú)藍(lán)染細(xì)胞(圖6)。

3 討論

鑒于hAECs對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的潛在治療作用和應(yīng)用前景，對(duì)hAECs的增殖、分化、成瘤性等細(xì)胞學(xué)鑒定十分必要。

在細(xì)胞學(xué)研究領(lǐng)域，用于檢測(cè)細(xì)胞活性及增殖的方法主要有3H-TdR摻入法和MTT比色法。3H-TdR摻入法雖然靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，但由于操作步驟多、存在放射性危害等限制了其使用。

MTT法的作用原理是MTT可作為哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞線(xiàn)粒體中琥珀酸脫氫酶的底物；當(dāng)活細(xì)胞存在時(shí)，線(xiàn)粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的MTT還原成紫藍(lán)色的晶狀甲臜，加入二甲基亞砜(DMSO)將結(jié)晶的甲臜溶解釋放，再用酶聯(lián)儀測(cè)定吸光度OD。此法與3H-TdR摻入法比較具有操作簡(jiǎn)便、無(wú)污染的特點(diǎn)。但需加入DMSO溶解才能比色，因此略顯繁瑣，且操作不當(dāng)會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)極大誤差。

近年來(lái)開(kāi)發(fā)的四唑鹽，如MTS、CCK-8等可替代MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。CCK-8試劑中含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽(WST-8)，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-M ethoxy PMS)的作用下，被細(xì)胞中的乳酸脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜染料，生成的甲臜量與活細(xì)胞數(shù)成正比，且甲臜量可用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度來(lái)衡量，利用此原理可進(jìn)行簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和活性分析[9-14]。MTS試劑由一種新型甲臜化合物2-對(duì)磺酸基苯基-3-(4,5-二甲基噻唑)-5-(3-羧甲氧基苯基)-二氫四唑嗡鹽(MTS)和一個(gè)電子偶聯(lián)劑(吩嗪硫酸二甲酯)PMS組成。活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶類(lèi)將MTS轉(zhuǎn)化成液態(tài)可溶性甲臜化合物，甲臜化合物的量與培養(yǎng)基中活細(xì)胞數(shù)成正比，且甲臜的量可用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度來(lái)衡量。與MTT相比，CCK-8、MTS可直接進(jìn)行比色，實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)便，也大大提高了實(shí)驗(yàn)的敏感性，并且避免了DMSO對(duì)細(xì)胞的不良影響[15]。

本研究探討MTS、CCK-8在hAECs增殖檢測(cè)中的靈敏度、最佳波長(zhǎng)、最適孵育時(shí)間，并且首次比較和探討了MTT、MTS和CCK-8對(duì)細(xì)胞的毒性。曾有實(shí)驗(yàn)證明，在細(xì)胞濃度1.25×103～1.6×105/孔范圍內(nèi)，CTLL-2細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)與OD450之間呈線(xiàn)性相關(guān)[16]。在本組實(shí)驗(yàn)中，加入CCK-8試劑的hAECs，在2×103～10×103/孔范圍內(nèi)，活細(xì)胞數(shù)與OD450值也呈線(xiàn)性關(guān)系；而MTS組細(xì)胞孵育一定時(shí)間后，OD雖然也隨細(xì)胞數(shù)的增加而增加，但線(xiàn)性關(guān)系與CCK-8相比稍差。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于hAECs的增殖測(cè)定，MTS法靈敏度略高于CCK-8法，兩種方法均快速、操作簡(jiǎn)便。由于MTT法需加入DMSO溶解甲臜顆粒，DMSO具有比較強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，DMSO組hAECs孵育4 h后出現(xiàn)固縮，臺(tái)盼藍(lán)可染成藍(lán)色，表明可能發(fā)生細(xì)胞凋亡或壞死。MTS組hAECs孵育4 h后細(xì)胞增殖受到抑制，但細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。CCK-8組 hAECs，細(xì)胞增殖及形態(tài)均無(wú)明顯變化。表明CCK-8的細(xì)胞毒性在同類(lèi)試劑中最小。

綜上所述，CCK-8和MTS均能較好檢測(cè)hAECs的體外增殖。相對(duì)于MTS法，CCK-8法是一種更經(jīng)濟(jì)、細(xì)胞毒性作用較弱的檢測(cè)試劑，值得推廣使用。

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Com parison of Experim ental Conditions of CCK-8 and M TS for Hum an Am niotic Epithelial Cells Proliferation Assay

LIU Yan-qiu,ZHANG Ke-hua,WANG Yun-liang,etal.Department of Immunology,Institute ofClinicalMedicine,China-Japan Friendship Hospital,Beijing 100029,China

Ob jectiveTo explore the optimal experiment conditions of CCK-8 and MTS for cell proliferation assays in human amniotic epithelial cells and to evaluate the cytotoxicity of these reagents.M ethodsHuman amniotic epithelial cells(hAECs)in logarithm grow th stages were prepared in different cell concentrations w ith DMEM/F12 and 10%FBS.The sensitivity and optimalwavelengths was determ ined based on the optical density(OD)measured at 450 nm and 492 nm.The optimal time was determ ined under the conditions of the same cell concentration and defined OD values.HAECswere treated w ith DMSO,CCK-8 and MTS for 1 h,2 h,3 h,and 4 h,respectively. 24 h later,cytotoxicity of the CCK-8 and MTSwas evaluated by determ ination of cell proliferation and Trypan Blue staining.Resu ltsThe optimal detection wavelength was 450 nm for CCK-8,and 492 nm for MTS.The sensitivity of CCK-8 was slightly lower then thatof MTS. The optimal time for incubation hAECs w ith CCK-8 was 4 h w ithin 1～4 h.The inhibitory on cell proliferation and cytotoxicity of CCK-8 were weaker then those of MTS.ConclusionCCK-8 is a convenient reagent w ith low cytotoxicity for detection of the proliferation of hAECs.

MTS;CCK-8;amniotic epithelial cells;cell proliferation;cytotoxicity

R446.61

A

1006-9771(2012)09-0827-04

2012-04-25

2012-04-27)

1.中日友好醫(yī)院，a.臨床醫(yī)學(xué)研究所免疫學(xué)研究室；b.婦產(chǎn)科，北京市100029；2.中國(guó)人民解放軍第148中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東淄博市255300。作者簡(jiǎn)介：劉艷秋(1984-)，女，山東淄博市人，碩士研究生，醫(yī)師，主要研究方向：神經(jīng)病學(xué)。通訊作者：蔡哲。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.09.010