趙 倩，解金輝，李雙玉，董 磊，種靖慧，閆莉娜，劉運德，袁玉華

(1.天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，天津 300203;2.天津市血液中心，天津 300110)

血友病A是由于遺傳性凝血因子VIII(FVIII)基因缺陷，造成血漿凝血因子VIII含量不足或功能缺陷，引起的一組終身出血的凝血障礙性疾病。凝血因子VIII是治療血友病的唯一有效用藥，它的生產(chǎn)原料就是血漿，而血漿的嚴(yán)重不足造成了目前凝血因子VIII一藥難求的局面，也造成了有些患者不治而亡。

血友病A的治療主要包括血漿來源的凝血因子VIII(plasma-derived FVIII，pdFVIII)和重組凝血因子VIII(recombinant FVIII，rFVIII)制劑。目前國內(nèi)對血友病A的治療仍以血漿凝血因子VIII濃縮劑為主，但有感染病毒性肝炎及艾滋病等傳染性疾病的危險[1]。由于rFVIII在生化、免疫、凝血活性及藥物動力學(xué)等方面與pdFVIII無明顯差別[2]，但在純度、抗原性、安全性、無自身血源性病毒感染等方面具有pdFVIII無法比擬的優(yōu)點，因此展示了良好的應(yīng)用前景。面對目前國內(nèi)凝血因子VIII的短缺，為了避免潛在的血液來源的病毒傳染，利用基因工程生產(chǎn)rFVIII成為解決其短缺的一個重要方法。本研究通過利用基因克隆技術(shù)，以BDDhFVIII為目的片段構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒，并觀察其在HepG2細(xì)胞中的分泌表達。

1 材料與方法

1.1 材料

含有B區(qū)缺失型(△760aa-1639aa)人凝血因子VIII基因片段的pCI-neo-BDDhFVIII質(zhì)粒由上海血液學(xué)研究所王鴻利教授惠贈。HepG2細(xì)胞為本實驗室保存，限制性內(nèi)切酶(Nhe I，Xho I)和T4 DNA連接酶購自Fermentas公司，F(xiàn)ast pfu DNA高保真酶、E.coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Ni-NTA瓊脂糖凝膠購自北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司，pcDNA4/v5-his載體、TrypLETMExpress和 Zeocin購自美國Invitrogen生物公司，DMEM和FBS購自Thermo公司，mouse anti-His IgG和Goat anti-mouse IgG-HRP購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，引物由上海英駿合成。

1.2 目的基因BDDhFVIII的擴增

參照GenBank的人凝血因子VIII基因序列(M14113.1)，采用Primer 5.0軟件設(shè)計引物并加入限制性內(nèi)切酶位點及保護堿基(Tab.1)。上游引物在5′端加了Nhe I限制性酶切位點和6個組氨酸，下游引物在5′端加了Xho I限制性酶切位點。以pCI-neo-BDDhFVIII為模板擴增目的片段，擴增產(chǎn)物的大小為4.4 kb。PCR擴增體系為:PCI-neo-BDDhFVIII 1μl，5 ×Buffer 10μl，dNTP(2.5 mmol/L)5μl，上游引物(10μmol/L)2μl，下游引物(10μmol/L)2μl，MgSO4(50mmol/L)1μl，F(xiàn)ast Pfu(2.5 U/μl)1μl，加 ddH2O至50μl。PCR反應(yīng)循環(huán)條件為:95℃預(yù)變性5 min，95℃40s、62℃40s、72℃2 min，共 30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng) 0.7%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，回收目的基因片段。

Tab.1 Sequence of the primers

1.3 重組真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

PCR擴增產(chǎn)物和pcDNA4/v5-his空載體分別用Nhe I和Xho I雙酶切，0.7%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收后T4 DNA連接酶將目的片段BDDhFVIII定向連接于真核表達載體pcDNA4/v5-his中。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含氨芐霉素(100mg/ml)的LB培養(yǎng)基篩選，挑取單克隆行菌落PCR，并抽提重組質(zhì)粒進行限制性酶切鑒定及送單克隆菌落至上海英駿公司測序。

1.4 Zeocin篩選濃度的確定

用胰酶消化處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，并以1×105cells/ml每孔接種于 96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200μl，在各孔中加入不同濃度梯度的Zeocin(e.g.50，100，200，300，400，500μg/ml)，一式兩孔 。每2天換液，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及存活率，連續(xù)培養(yǎng)14 d，挑選HepG2細(xì)胞恰好死亡的Zeocin的濃度即為Zeocin的篩選濃度。

1.5 重組表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

采用電轉(zhuǎn)介導(dǎo)重組真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染當(dāng)天收集HepG2細(xì)胞加入無抗生素含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，取30μl細(xì)胞懸液加入1μl純化的連接液，冰上放置60s后，將混合液加入預(yù)冷的電擊杯，BioRod電轉(zhuǎn)化儀，0.1電轉(zhuǎn)化杯，1 Kv，5 ms，電擊。向電轉(zhuǎn)化杯加入500μl含10%FBS且無抗生素的DMEM 培養(yǎng)基，將混合液洗出，加于24孔板的細(xì)胞懸液中，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng) 。取 1μl pcDNA4/v5-his空載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞作為對照組步驟同上。轉(zhuǎn)染后48 h，加入Zeocin篩選陽性細(xì)胞，每2～3天換液一次，繼續(xù)培養(yǎng)擴增，直至細(xì)胞擴增達到可以移至25 ml的培養(yǎng)瓶中進行傳代培養(yǎng)。

1.6 Ni-NTA純化及Western blot檢測

分別收集24h，48 h，96 h及144h重組真核表達質(zhì)粒pcDNA4/v5-his-BDDhFVIII轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)7%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)，然后分別結(jié)合對應(yīng)一抗(anti-His鼠源單克隆抗體，1∶1000稀釋)及二抗(Goat anti-mouse IgG-HRP，l∶2500稀釋)，暗室曝光。結(jié)合 Western blot圖選取重組蛋白分泌最多的時間點，收集該時間點重組真核表達質(zhì)粒 pcDNA4/v5-his-BDDhFVIII轉(zhuǎn)染組及空載體pcDNA4/v5-his轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液進行Ni-NTA 純化 ，10mmol，20mmol，250mmol咪唑梯度洗脫，結(jié)合在Ni-NTA柱上的重組蛋白經(jīng)250mmol咪唑洗脫三次并留樣(Elution 1，Elution 2，Elution 3)。純化樣本變性后Western blot檢測，步驟同上。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴增

以含有BDDhFVIII的重組質(zhì)粒PCI-neo為模板，F(xiàn)ast pfu DNA高保真酶擴增含有Nhe I、Xho I雙酶切位點及 6×His標(biāo)簽的目的片段，將PCR產(chǎn)物在0.7%的瓊脂糖凝膠中電泳，可見一條長約4.4 kb的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。

2.2 重組真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

PCR產(chǎn)物及pcDNA4/v5-his空載體經(jīng)Nhe I和Xho I雙酶切及膠回收，T4 DNA連接酶16℃連接過夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素LB平皿篩選，選取單克隆菌落搖菌提質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)Nhe I或Xho I單酶切可見一條長約9.5 kb的條帶，Nhe I、Xho I雙酶切可見4.4 kb和5.1 kb兩條帶(圖2A)。送陽性克隆株進行測序，結(jié)果與GenBank報道序列完全一致(見圖2B)。酶切及測序正確的重組真核表達質(zhì)粒命名為pcDNA4/v5-his-BDDhFVIII。

Fig.1 Analysis of PCR product of BDDhFVIII

Fig.2 Identification of recombinant plasmid pcDNA4/v5-his-BDDhFVIII

2.3 Zeocin篩選濃度的確定及重組真核表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

HepG2細(xì)胞選取的Zeocin濃度為 300μg/ml，該濃度培養(yǎng)條件下細(xì)胞在第14天時恰好完全死亡。重組表達質(zhì)粒 pcDNA4/v5-his-BDDhFVIII及空載體pcDNA4/v5-his電轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)條件為未加篩選抗生素的含10%(v/v)FBS的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后加入300μg/ml的Zeocin和10%P/S。

2.4 采用Ni-NTA純化及Western blot檢測

從pcDNA4/v5-his-BDDhFVIII轉(zhuǎn)染組24h，48 h，96 h及144h HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液Western blot結(jié)果(圖3A)可見96 h細(xì)胞培養(yǎng)液中，大小約為160kD的重組蛋白分泌最多，而144h時重組蛋白出現(xiàn)了部分降解。故收集96 h重組表達質(zhì)粒pcDNA4/v5-his-BDDhFVIII轉(zhuǎn)染組及空載體pcDNA4/v5-his轉(zhuǎn)染組HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液進行Ni-NTA純化，純化樣本變性后Western blot檢測如圖3B，可見pcDNA4/v5-his-BDDhFVIII轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)液Ni-NTA純化后條帶明顯比未純化的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液的條帶濃重。且洗脫液2(Elution 2)是最亮的，而空載體pcDNA4/v5-his轉(zhuǎn)染組未見條帶。

Fig.3 Expression of BDDhFVIII in transfected HepG2 cells detected by Western blot

3 討論

凝血因子VIII在血漿中的含量極微并且分離純化的難度極大，其基因和蛋白結(jié)構(gòu)一直是人們試圖著手之處，直到Gitschier和Wood等在1984年首先采用蛋白分離純化技術(shù)完成了人凝血因子VIII cDNA全長的克隆和測序工作，并在體外培養(yǎng)的COS細(xì)胞中獲得低水平表達，凝血因子VIII的重組表達就成為了人們研究的熱點。野生型人凝血因子VIII cDNA大約為7 kb，根據(jù)其內(nèi)部序列的同源性分成3個A區(qū)、1個B區(qū)和2個C區(qū)，排列成A1-A2-B-A3-C1-C2結(jié)構(gòu)[3，4]。B 區(qū)(約 3 Kb)在凝血因子 VIII的活化過程中被全部切除，缺失型凝血因子VIII與野生型凝血因子VIII具有相同的生物學(xué)特性，凝血酶酶切產(chǎn)物、凝血酶活化效率、和vWF的結(jié)合能力與野生型之間也沒有區(qū)別，卻解決了載體包裝容量的限制，且表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)更為簡單[5-7]。

過去的20年中，可觀的臨床實驗結(jié)合市場調(diào)查研究充分表明rFVIII制劑用于臨床治療出血或預(yù)防出血發(fā)作的安全性和高效性[6，8]。rFVIII制劑是目前血友病A治療的研究方向，并且已經(jīng)成為大多數(shù)血友病治療中心對血友病A患者治療的首選藥物[9]。面對國內(nèi)凝血因子VIII的短缺，進口rFVIII的昂貴，同時為了避免潛在的血液來源的病毒傳染，現(xiàn)階段研發(fā)生產(chǎn)凝血因子VIII有著積極的意義。

His-Tag融合蛋白是目前最常見的表達方式，而且很成熟，它的優(yōu)點是表達方便而且基本不影響蛋白的活性，并可以用固定金屬離子親和色譜法(IMAC)純化。金屬鎳可與6個組氨酸特異性結(jié)合，并可被含不同濃度咪唑的洗脫緩沖液所洗脫，故采用鎳結(jié)合柱對收集的細(xì)胞培養(yǎng)液進行過柱吸附并洗脫以達到純化的目的。由于上游引物設(shè)計時加了6個組氨酸，這就使重組蛋白N端帶上了His-Tag。凝血因子VIII是個微量的胞外分泌蛋白，收集細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)Ni-NTA純化就增加了其可檢測性。同時由于融合表達產(chǎn)物中含有His-Tag，故選擇anti-His單克隆抗體作為一抗，使實驗更經(jīng)濟可行。pcDNA系列載體被廣泛應(yīng)用于真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及其后續(xù)功能研究中，該載體含有一個位于起始密碼子上游的高效翻譯增強子，可以明顯提高轉(zhuǎn)錄效率而增加重組蛋白的產(chǎn)量，為體外大量獲得rFVIII提供了可能。

由于凝血因子VIII高表達于肝臟，所以選擇了肝組織細(xì)胞HepG2進行重組蛋白的表達。pcDNA4/v5-his-BDDhFVIII經(jīng)酶切及測序顯示其序列無誤，而且轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)液未純化與經(jīng)Ni-NTA純化后在160KD處均可見條帶，而空載體pcDNA4/v5-his轉(zhuǎn)染組在160KD處未見條帶，從而證實pcDNA4/v5-his-BDDhFVIII重組真核表達質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染了HepG2細(xì)胞。經(jīng)過Zeocin的篩選HepG2細(xì)胞持續(xù)表達重組蛋白，故成功構(gòu)建了表達BDDhFVIII的穩(wěn)定細(xì)胞系，從而為后續(xù)進一步研究凝血因子VIII奠定了實驗基礎(chǔ)。

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