楊政興， 嚴 偉， 陳忠銘， 劉美寶， 李 炤

腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，占男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤的28.7%，約30%的腎癌患者首次就診時即已屬晚期［1］。美國轉(zhuǎn)移性腎癌患者的2年生存率在0～20%之間波動［2］。腎癌具有多藥物耐藥基因，對化學治療及放療不敏感。非特異性免疫治療白細胞介素-2(IL-2)或干擾素-α(IFN-α)聯(lián)合應用雖被公認是腎癌的第一線治療方案，但只有少數(shù)患者受益，顯然急需新的治療策略［3］。索拉非尼(sorafenib)是一種新型靶向抗腎癌藥物，2008年NCCN腫瘤治療指南已經(jīng)將sorafenib應用于晚期腎癌的一線治療。目前sorafenib與其他靶向治療藥物、細胞因子、化療藥物聯(lián)合應用治療晚期腎癌的多個臨床試驗正在進行或即將開始，部分試驗已初步顯示出其療效顯著。本文通過研究sorafenib對人腎癌荷瘤裸鼠血清IL-2及TNF-α水平的影響，進一步探討sorafenib與細胞因子之間的關(guān)系，旨在為臨床聯(lián)合用藥，提高療效，擴大適應證范圍提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及腎癌細胞株 BALB/c-nu/nu裸鼠由北京維通利華實驗技術(shù)公司提供(SPF級)，33只，4 周齡，體重(14.0 ±0.5)g，雌雄各半。OS-RC-2腎癌細胞株購于上海中科院。

1.2 主要試劑 sorafenib購于拜耳公司，200 mg/片;ELISA試劑盒(檢測IL-2及TNF-α水平)購于美國BMS公司;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于?？寺∩锘瘜W制品(北京)有限公司。

1.3 OS-RC-2腎癌細胞的培養(yǎng)及細胞懸液制作OS-RC-2腎癌細胞株于含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基、37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)基，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液傳代，每3天傳代1次。當OS-RC-2腎癌細胞生長至對數(shù)生長期時，用 0.25%胰蛋白酶 +0.02%EDTA消化液離心收集OS-RC-2細胞，PBS洗3次，用PBS重懸OS-RC-2細胞，調(diào)整細胞濃度為2.5×106個/150μL。

1.4 裸鼠人腎癌模型的建立及鑒定 BALA/c-nu/nu裸鼠，用4%水合氯醛(0.1mL/10g)麻醉后，用帶25號針頭1 mL注射器分別吸取上述OS-RC-2細胞懸液150μL，注射于每只裸鼠于左前肢腋部皮下，共33只。1周后皮下瘤塊形成，隨機選取3只裸鼠，處死后取皮下瘤塊行病理檢查，確定OS-RC-2細胞瘤塊造模成功。

1.5 實驗分組及給藥 選取經(jīng)鑒定合格裸鼠人腎癌模型(接種后1周)30只，隨機分3組:對照組、sorafenib低劑量組及sorafenib高劑量組各10只。對照組:1 mL PBS灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃14天;sorafenib低劑量組:sorafenib按20 mg/kg劑量，溶于1 mL PBS灌胃給藥，每天1次，連續(xù)灌胃14天;sorafenib高劑量組:sorafenib按80 mg/kg劑量，溶于1mL PBS灌胃給藥，每天1次，連續(xù)灌胃14天。

1.6 IL-2及TNF-α測定 分別于給藥后第7天及14天，隨機選取對照組、低劑量組及高劑量組各5只，通過眼球摘除法采血，每只小鼠采血量約為0.5 mL，用ELISA法測定給藥后第7、14天各組血清中細胞因子IL-2和TNF-α水平。具體實驗步驟按照試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(x±s)表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩組間均數(shù)比較采用 LSD-t法檢驗，α =0.05，以 P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥后第7天sorafenib對人腎癌荷瘤裸鼠血清中IL-2及TNF-α的影響(表1) 由表1可見，sorafenib低劑量組及高劑量組血清中IL-2含量明顯低于對照組(P＜0.05);sorafenib高劑量組血清中TNF-α含量明顯低于對照組(P＜0.05)。

表1 給藥后第7天人腎癌荷瘤裸鼠血清中IL-2及TNF-α的含量±s，n=5)

表1 給藥后第7天人腎癌荷瘤裸鼠血清中IL-2及TNF-α的含量±s，n=5)

*:與對照組相比，P ＜0.05;△:與對照組相比，P ＜0.05。

組別 IL-2(ng/L) TNF-α(ng/L)對照組 1.77 ±0.36 1.34 ±0.21 sorafenib 低劑量組 1.38 ±0.16* 1.32 ±0.26 sorafenib高劑量組 1.34 ±0.30* 1.07 ±0.26△

2.2 給藥后第14天sorafenib對人腎癌荷瘤裸鼠血清中IL-2及TNF-α的影響(表2) 由表2可見，對照組、sorafenib低劑量組及高劑量組血清中IL-2含量兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05);對照組、sorafenib低劑量組及高劑量組血清中TNF-α含量兩兩比較差異也均無統(tǒng)計學意義(均 P＞0.05)。

表2 給藥第14天后人腎癌荷瘤裸鼠血清中IL-2及TNF-α的含量±s，n=5)

表2 給藥第14天后人腎癌荷瘤裸鼠血清中IL-2及TNF-α的含量±s，n=5)

組別 IL-2(ng/L) TNF-α(ng/L)對照組 0.75 ±0.09 0.75 ±0.20 sorafenib 低劑量組 0.71 ±0.06 0.65 ±0.04 sorafenib高劑量組0.79 ±0.15 0.61 ±0.12

3 討論

根治性腎切除術(shù)為腎癌目前首選的治療方法，但術(shù)后及轉(zhuǎn)移性腎癌目前尚無標準的輔助治療方案。由于腎癌對放化療均不敏感，所以免疫治療就成為目前臨床上治療晚期轉(zhuǎn)移性腎癌的主要治療手段。然而研究表明，只有約15%的患者對細胞因子IL-2和IFN-α的免疫治療敏感，而其他大部分患者不敏感，效果不理想［4］。有學者進行了局限性晚期腎細胞癌行全腎切除后是否應用IFN-α及IL-2治療的隨機對照研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，術(shù)后細胞因子的輔助治療在延緩復發(fā)時間和延長患者生存期上并沒有明顯優(yōu)勢［5-6］。

索拉非尼(sorafenib)是一種新型抗腎細胞癌的分子靶向藥物，其為多靶點酪氨酸激酶抑制劑，能通過抑制RAF-MEK-ERK信號傳導通路直接抑制腫瘤生長，還能通過抑制VEGF、PDGF及EGF等生長因子的表達而阻斷腫瘤新生血管的形成而間接抑制腫瘤細胞的生長［7］。Strumberg 等［8］開展了 sorafenib的Ⅰ期臨床試驗，應用劑量范圍為50～800 mg(bid)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該藥的最大耐受劑量為400 mg，在超過最大耐受劑量時會有皮疹、腹瀉、疲勞以及高血壓等毒副反應產(chǎn)生，需要停止治療。Ratain等［9］報道了一項隨機非連續(xù)性的Ⅱ期臨床試驗，結(jié)果顯示sorafenib治療腎癌有效，顯著延長了無進展生存期。而隨后 Escudier等［10］進行了 sorafenib與安慰劑隨機雙盲對照的Ⅲ期臨床試驗，驗證sorafenib治療腎癌可延長腎癌患者的無進展生存期。根據(jù)Ⅰ～Ⅲ期臨床試驗的結(jié)果，美國FDA于2005年12月批準本藥在臨床上用于治療腎癌患者。

目前，有關(guān)sorafenib聯(lián)合干擾素、白介素的治療腎癌的研究甚少。本研究通過檢驗sorafenib對人腎癌荷瘤裸鼠血清IL-2及TNF-α水平，進一步探討sorafenib與細胞因子之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥后第7天，sorafenib低劑量組及高劑量組人腎癌荷瘤裸鼠血清中IL-2的含量低于對照組，sorafenib高劑量組人腎癌荷瘤裸鼠血清中TNF-α的含量低于對照組;而給藥后第14天，對照組、sorafenib低劑量組及sorafenib高劑量組人腎癌荷瘤裸鼠血清中IL-2、TNF-α的含量均無差異。說明sorafenib對人腎癌荷瘤裸鼠IL-2及TNF-α的表達有影響，但影響較短暫且遠期影響并不明確。此外，sorafenib與干擾素、白介素之間的具體作用方式、作用機制、遠期影響等均不清楚，還需進一步研究。

綜上，sorafenib對人腎癌荷瘤裸鼠IL-2及TNF-α的表達雖有影響，但較為短暫，遠期相互作用也不明確，還需進行更廣泛的實驗研究，為sorafenib聯(lián)合干擾素、白介素應用于腎癌的臨床治療提供更多的依據(jù)。

［1］袁香慶，崔傳亮，斯璐，等.化療聯(lián)合CIK細胞回輸治療轉(zhuǎn)移性腎細胞癌Ⅱ期臨床研究［J］.腫瘤學雜志，2008，14(5):362-365.

［2］Heldwein FL，Escudier B，Smyth G，et al.Metastatic renal cell carcinoma management［J］.Int Braz J Urol，2009，35(3):256-270.

［3］王肇炎.腎癌的靶向藥物治療進展［J］.實用腫瘤雜志，2008，23(6):491-493.

［4］吳永吉，劉碩，袁愛民，等.IL-2聯(lián)合α干擾素對局部進展期腎癌患者療效觀察［J］.河北醫(yī)藥，2009，31(22):3099-3100.

［5］Messing EM，Manola J，Wilding G，et al.PhaseⅢ study of interferon alfa-NL as adjuvant treatment for resectable renal cell carcinoma:an Eastern Cooperative Oncology Group/Intergroup trial［J］.J Clin Oncol，2003，21(7):1214-1222.

［6］Clark JI，Atkins MB，Urba WJ，et al.Adjuvant high-dose bolus interleukin-2 for patients with high-risk renal cell carcinoma:a cytokine working group randomized trial［J］.J Clin Oncol，2003，21(16):3133-3140.

［7］夏克良.索拉非尼治療晚期轉(zhuǎn)移性腎癌的現(xiàn)況及展望［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2010，29(14):110-111.

［8］Strumberg D，Awada A，Hirte H，et al.Pooled safety analysis of BAY 43-9006(sorafenib)monotherapy in patients with advanced solid tumours:Is rash associated with treatment outcome［J］.Eur J Cancer，2006，42(4):548-556.

［9］Ratain MJ，Eisen T，Stadler WM，et al.Phase II placebo-controlled randomized discontinuation trial of sorafenib in patients with metastatic renal cell carcinoma［J］.J Clin Oncol，2006，24(16):2505-2512.

［10］Escudier B，Eisen T，Stadler WM，et al.Sorafenib in advanced clear-cell renal-cell carcinoma［J］.N Engl J Med，2007，356(2):125-134.