楊麗霞，郭瑞威，齊峰，石燕昆，王先梅，任麗，徐安妨

動脈粥樣硬化斑塊形成是多種炎性因子、趨化因子及核轉(zhuǎn)錄因子共同參與調(diào)控的炎癥網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)?；罨疶細胞核因子(NFAT)是一類在炎癥反應中增強基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核轉(zhuǎn)錄因子，在動脈粥樣硬化炎癥反應的特征性細胞—單核/巨噬細胞上有NFAT的表達［1］，NFAT可能通過調(diào)控炎癥因子的轉(zhuǎn)錄導致動脈粥樣硬化炎癥反應的發(fā)生。單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)是動脈粥樣硬化炎癥反應中的重要趨化因子，研究發(fā)現(xiàn)MCP-12518G/A基因多態(tài)性在冠心病尤其是急性冠狀動脈(冠脈)綜合征發(fā)病中發(fā)揮著重要作用［2］，但具體機制尚不明確。本研究通過測定NFAT、MCP-1濃度、MCP-12518G/A基因多態(tài)性及冠脈病變Gensini評分，分析它們與冠心病的關(guān)系。

1 資料與方法

臨床資料:選擇2009-01-10至2010-01-10成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院心內(nèi)科住院行冠脈造影的患者360例，根據(jù)造影結(jié)果確診為冠心病的患者分為急性冠脈綜合征組180例、穩(wěn)定型心絞痛組120例和冠脈造影結(jié)果正常者為對照組60例。急性冠脈綜合征組包括急性ST段抬高型心肌梗死60例、非ST段抬高型心肌梗死60例和不穩(wěn)定型心絞痛60例。急性心肌梗死、不穩(wěn)定型心絞痛、穩(wěn)定型心絞痛診斷均符合美國心臟病協(xié)會/美國心臟病學會(AHA/ACC)診斷標準，冠心病診斷經(jīng)冠脈造影檢查至少有一支血管病變狹窄程度≥50%，不穩(wěn)定型心絞痛患者同時行計算機斷層攝影術(shù)血管成像(CTA)檢查，病變?yōu)檐洶邏K(計算機斷層攝影術(shù)值小于50 Hu)。排除合并腦卒中、周圍血管疾病或者血管栓塞性疾病、嚴重肝腎功能不全、感染、自身免疫疾病、哮喘及腫瘤患者。

標本處理:急性冠脈綜合征組患者急診入院時即刻采血，其余患者于入院次日清晨(空腹12 h)采血，抗凝管取肘靜脈血3ml 3000 r/min離心10 min，分離血清于－80℃冰箱凍存待測。同時采肘靜脈血用全自動生化儀測定總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和血糖等生化指標。

冠狀動脈造影:采用Judkins法。冠脈狹窄程度的評價，采用美國 Coronary Artery Surgery Study(CASS)診斷標準和Gensini評分標準，狹窄≤25%為1分，25% ～50%為 2分，50% ～75%為 4分，75% ～90%為8分，90% ～99%為16分，100%(閉

統(tǒng)計學方法:用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析，正態(tài)分布計量資料用表示，計量資料多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，MCP-1基因型計數(shù)資料采用χ2檢驗，服從正態(tài)分布兩變量計量資料的相關(guān)性分析采用peanson’s相關(guān)系數(shù)分析，冠脈病變Gensini評分與NFAT、MCP-1-2518G/A基因多態(tài)相關(guān)性采用多元回歸分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

各組間生化指標及活化T細胞核因子、單核細胞趨化蛋白-1的比較:由表1可見急性冠脈綜合征組、穩(wěn)定型心絞痛組NFAT、MCP-1、低密度脂蛋白膽固醇、血糖均高于對照組，而高密度脂蛋白膽固醇急性冠脈綜合征組、穩(wěn)定型心絞痛組均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。急性冠脈綜合征組NFAT、MCP-1、低密度脂蛋白膽固醇均高于穩(wěn)定型心絞痛組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。經(jīng)peanson’s相關(guān)分析顯示，NFAT濃度與MCP-1水平呈正相關(guān)(r=0.69，P＜0.05)。圖1塞)為32分。不同節(jié)段冠脈評分系數(shù)按Gensini標準，狹窄程度評分再乘以一個標志病變位置，左主干×5;左前降支近段×2.5;中段×1.5;遠段×1;第一對角支×1;第二對角支×0.5;左回旋支近段×2.5，遠段和后降支、鈍緣支均×1，后側(cè)支×0.5;右冠近、中、遠段和后降支均×1，每例患者冠脈病變程度的最終積分為各分支積分之和。

酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定活化T細胞核因子、單核細胞趨化蛋白-1水平:NFAT試劑盒、MCP-1試劑盒購自大連泛邦生物工程有限公司，操作步驟嚴格按照說明書進行。

單核細胞趨化蛋白-1基因多態(tài)性檢測:①脫氧核糖核酸(DNA)的制備，嚴格按照DNA提取試劑盒說明書提取 DNA，試劑盒購自北京 TIANGEN公司。②多聚酶鏈反應(PCR)擴增采用引物的序列［2］:上游引物:5'-CCGAGATGTTCCCAGCACAG-3'，下游引物:5'-CTGCTTTGTTTGTGCCTCTT-3'。反應條件:94℃預變性 5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，31個循環(huán)，72℃延伸10 min。限制性內(nèi)切酶PvuⅡ?qū)CR擴增產(chǎn)物在37℃下進行酶切。取6 μl酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外燈下觀察、拍照及分析。

表1 冠心病各組間活化T細胞核因子、單核細胞趨化蛋白-1濃度及其他生化指標比較()

表1 冠心病各組間活化T細胞核因子、單核細胞趨化蛋白-1濃度及其他生化指標比較()

注:與對照組比較*P＜0.05;與穩(wěn)定型心絞痛組比較△P＜0.05。NFAT:活化T細胞核因子 MCP-1:單核細胞趨化蛋白-1 LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇 HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇

例數(shù) NFAT(pg/ml)MCP-1(pg/ml)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)血糖(mmol/L)對照組 60 25.92±3.91 112.52±9.95 2.53±0.25 1.40±0.33 4.89±0.77穩(wěn)定型心絞痛組 120 28.48±3.81* 127.24±14.53* 2.79±0.38* 1.27±0.27* 6.25±1.83*急性冠脈綜合征組 180 31.96±4.49＊△ 149.47±18.10＊△ 2.97±0.35＊△ 1.12±0.13* 6.98±2.19*

圖1 活化T細胞核因子和單核細胞趨化蛋白-1的關(guān)系散點圖

活化T細胞核因子、單核細胞趨化蛋白-1與冠脈病變Genisini評分多元逐步回歸分析:以冠脈病變Gensini評分為應變量，以各危險因素為自變量進行多元逐步回歸分析，有五個因素進入回歸方程，依次為高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、血糖、NFAT、MCP-1，結(jié)果顯示冠脈病變 Gensini評分與NFAT、MCP-1、血糖、低密度脂蛋白膽固醇水平呈正相關(guān)，與高密度脂蛋白膽固醇呈負相關(guān)(t值=－4.08)。表2

表2 各因素與冠狀動脈病變Gensini評分多元逐步回歸分析

單核細胞趨化蛋白-1基因多態(tài)性分析:圖2可見，GG純合子酶切為708 bp和222 bp兩種片段;AG雜合子酶切后為930 bp、708 bp和222 bp三種片段;若為AA純合子則因無酶切位點而僅顯示930 bp一種片段。

圖2 單核細胞趨化蛋白-12518位點PVUⅡ酶切圖M:分子量標記 圖中AG、GG、AA為基因型

三種類型基因間單核細胞趨化蛋白-1濃度比較及各組基因型及等位基因頻率分布:MCP-1濃度在GG型基因為(152.69±21.78)pg/ml高于AG型基因(136.16±18.15)pg/ml，AG型基因高于 AA型基因(123.66±14.92)pg/ml，三種類型基因比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。各基因型間性別、年齡、體重、血糖、血脂比較差異均無統(tǒng)計學差異。MCP-1基因多態(tài)及等位基因頻率在冠心病患者(急性冠脈綜合征組、穩(wěn)定型心絞痛組)及對照組分布符合 Hardy-Weinberg遺傳平衡規(guī)律，表3各組單核細胞趨化蛋白-1基因型及等位基因頻率分布可見，急性冠脈綜合征組GG型基因和G等位基因頻率較穩(wěn)定型心絞痛組及對照組增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表3 各組單核細胞趨化蛋白-1基因型及等位基因頻率分布

3 討論

作為體內(nèi)重要核轉(zhuǎn)錄因子，NFAT是參與機體免疫反應細胞因子基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，眾多細胞因子基因調(diào)控區(qū)有NFAT的結(jié)合位點，NFAT能與鋅指結(jié)構(gòu)(bZIP)結(jié)合為協(xié)同復合體，形成一延伸的接觸面，從而促進基因的轉(zhuǎn)錄過程［3］。我們分析了NFAT與冠心病的相關(guān)性及它與 MCP-1之間的聯(lián)系，結(jié)果顯示，血清NFAT水平在急性冠脈綜合征組較穩(wěn)定型心絞痛組升高，穩(wěn)定型心絞痛組較對照組升高，GS評分結(jié)果也表明NFAT與冠脈病變狹窄程度相關(guān)，提示NFAT也可能是參與冠心病的發(fā)病的一個核轉(zhuǎn)錄因子。

MCP-1特異作用于單核/巨噬細胞，激活啟動炎癥反應，有研究結(jié)果顯示冠心病多種危險因素血糖、血脂代謝異常、氧化應激均能引起 MCP-1 升高［4，5］，MCP-1作用于其特異受體一方面能激活單核細胞使細胞內(nèi)Ca2+濃度增加和呼吸爆發(fā)，釋放溶酶體酶形成脂質(zhì)池不斷引起動脈粥樣硬化斑塊纖維帽變薄破裂［6，7］;另一方面 MCP-1還能激活單核細胞內(nèi)絲裂素激酶級聯(lián)反應，介導多種轉(zhuǎn)錄因子、炎性細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等活化導致斑塊破裂［8］。因此MCP-1在動脈粥樣硬化炎癥反應及急性冠脈綜合征易損斑塊的進展及破裂的過程中發(fā)揮有重要作用，我們對MCP-1與冠心病的相關(guān)性研究結(jié)果顯示，血清MCP-1水平在急性冠脈綜合征組較穩(wěn)定型心絞痛組升高，穩(wěn)定型心絞痛組較對照組升高，顯示MCP-1在冠心病及急性冠脈綜合征發(fā)病中發(fā)揮有重要作用。而且冠脈病變Genisini評分也與MCP-1水平呈正相關(guān)，這表明MCP-1水平與冠心病嚴重程度有一定的聯(lián)系。

MCP-12518G/A位點位于MCP-1基因啟動子區(qū)域，此處突變導致的AG、GG型基因可能增加啟動子區(qū)域內(nèi)的GC盒子，而GC盒是在MCP-1啟動子近端調(diào)控區(qū)上特異結(jié)合刺激蛋白-1增強轉(zhuǎn)錄的靶點，最終引起MCP-1蛋白表達水平的增高［9］。在我們的研究中，MCP-1水平在三種不同基因型中分析表明GG型較AG型升高，AG型較AA型升高，說明不同基因型冠心病患者MCP-1水平存在差異，不同基因型可能調(diào)控MCP-1的表達。Szalai等［10］研究了318例冠心病患者，認為MCP-12518G/A的變異可能是冠心病易感發(fā)病的遺傳危險因素。Mcderotte等［11］發(fā)現(xiàn)該位點基因多態(tài)性與缺血性心臟病相關(guān)。Jemaa等［12］近期的研究提示MCP-1基因的2518G/A多態(tài)性與心肌梗死相關(guān)。我們的研究結(jié)果顯示MCP-12518G/A基因多態(tài)性在急性冠脈綜合征組GG型基因和G等位基因頻率分布較穩(wěn)定型心絞痛組及對照組升高，AA型基因和A等位基因頻率分布較穩(wěn)定型心絞痛組及對照組降低。這表明GG型基因及G型等位基因與冠心病的嚴重程度相關(guān)，GG型基因及G型等位基因在冠心病尤其是急性冠脈綜合征易損斑塊炎癥反應中可能發(fā)揮重要作用。

綜上所述，NFAT與MCP-1的血漿濃度與冠心病發(fā)病有相關(guān)性，可能成為冠心病的預測指標，并且MCP-12518G/A基因多態(tài)性與冠脈病變嚴重程度也明顯相關(guān)。

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