譚龍濤，喻春明，陳平，王延周，陳繼康，溫嵐，熊和平

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所，湖南長(zhǎng)沙410205)

作物品種純度的快速、準(zhǔn)確鑒定是作物品種資源保存、研究和利用過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的方法是依靠種子或植株的表型性狀來(lái)鑒別不同的個(gè)體，雖然該方法比較直觀、簡(jiǎn)便，但由于可直接觀測(cè)的農(nóng)藝性狀十分有限，而且有些性狀要在特定的生育期才能檢測(cè)，因此表型性狀的檢測(cè)受到很大限制，對(duì)親緣關(guān)系較近的個(gè)體的檢測(cè)則尤為困難。分子標(biāo)記技術(shù)做為作物品種純度鑒定的有效方法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于水稻［1］、玉米［2］、棉花［3］、白菜［4］、大豆［5］等植物 。但是在植物居群遺傳多樣性的研究中，還存在著遺傳多樣性參數(shù)種類(lèi)的確定，樣本大小估測(cè)群體遺傳多樣性參數(shù)的可靠性等問(wèn)題。

在遺傳多樣性比較過(guò)程中，選擇恰當(dāng)?shù)倪z傳多樣性參數(shù)和有代表性的樣本量，使檢測(cè)到的遺傳多樣性及其估算的參數(shù)具有較高的可信性［6－7］。趙茹等對(duì)野生大豆居群遺傳多樣性估算與取樣策略的研究結(jié)果表明，不同分子標(biāo)記檢測(cè)到同一野生大豆居群的各種遺傳參數(shù)值不同。同一居群中的不同樣本量對(duì)遺傳多樣性參數(shù)的估算值有較大的影響，當(dāng)選用多態(tài)位點(diǎn)百分率 (P)時(shí)，30－45個(gè)植株才能代表總體90%以上的遺傳變異［8］。關(guān)于苧麻群體檢測(cè)樣本量的選擇，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。

SSR標(biāo)記具有共顯性、多態(tài)性相對(duì)豐富、基因組覆蓋較多等優(yōu)點(diǎn)［9］，而且該技術(shù)簡(jiǎn)單快捷，穩(wěn)定性高?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析和系統(tǒng)學(xué)研究方面［10－11］。SRAP標(biāo)記具有高效、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、產(chǎn)率高、易測(cè)序、便于克隆目標(biāo)片段的特點(diǎn)。目前已成功在作物遺傳多樣性分析、基因定位重要性狀的標(biāo)記、比較基因組學(xué)、遺傳圖譜的構(gòu)建以及相關(guān)基因的克隆等方面得到廣泛應(yīng)用［12－14］。

本研究以中苧1號(hào)種子苗為研究材料，選取了31對(duì)SSR引物和48對(duì)SRAP引物進(jìn)行分子標(biāo)記，對(duì)苧麻品種的主要遺傳多樣性參數(shù)隨抽樣群體樣本量的變化規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)研究，為苧麻群體遺傳多樣性研究的取樣策略提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為開(kāi)放授粉中苧1號(hào)種子苗，栽培于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所國(guó)家種質(zhì)苧麻圃。

1.2 DNA的提取

由于苧麻葉中含有大量的酚類(lèi)物質(zhì)，為了獲得較高純度的基因組DNA，本試驗(yàn)對(duì)CTAB法進(jìn)行了改良，通過(guò)延長(zhǎng)抽提時(shí)間和加抗氧化劑的方法提高純度。用BeckMan DU800分光光度計(jì)測(cè)定DNA的純度和濃度，并稀釋到約45ng/μL。

1.3 SSR和SRAP引物的來(lái)源

31對(duì)SSR引物和48對(duì)SRAP引物由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所苧麻種質(zhì)資源課題組提供。

1.4 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)

SSR反應(yīng)體系每25μL體系中含有DNA模板為45ng，引物0.15μmol/L，Taq酶用量1.5U，dNTPs為0.15mmol/L。反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，50、55或60℃(根據(jù)引物的退火溫度而定)復(fù)性50s，72℃延伸1min，30次循環(huán)后，72℃延伸5min。

SRAP反應(yīng)體系為20μL，其中10×Tag buffer 2μL，dNTPs(5mmol/L)0.4μL，5’引物和3’引物 (0.1nm/μl)各0.6μL，Tag酶 (5U/μL)0.4μL，DNA 模板 2μL，加 ddH2O 至 20μL。反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性1min，94℃變性1min，33℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，循環(huán)5次，然后94℃變性1min，55℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸5min。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)從中苧1號(hào)種子苗群體中隨機(jī)選取100蔸，并從中隨機(jī)抽取10、20、30、40、50、60、70、80，90個(gè)個(gè)體組成抽樣群體，計(jì)算其遺傳多樣性參數(shù)，每個(gè)抽樣群體重復(fù)5次。分子標(biāo)記結(jié)果采用人工讀帶的方法，將電泳圖上可重復(fù)的、清晰的條帶記為“1”，同一位置無(wú)帶記為“0”，條帶缺失數(shù)據(jù)記為“2”。用POPGENE2.0軟件對(duì)整理的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算不同抽樣群體的遺傳多樣性參數(shù)的平均值，主要的遺傳多樣性參數(shù)有觀測(cè)雜合度 (Ho)，期望雜合度(He)，shannon遺傳多樣性指數(shù) (I)，遺傳有效等位基因數(shù)目 (Ne)和平均等位基因數(shù) (Na)。然后用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)抽樣群體隨樣本量的增加遺傳多樣性水平變化趨勢(shì)進(jìn)行擬合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記抽樣樣本量與遺傳多樣性參數(shù)的關(guān)系

表1顯示了遺傳多樣性參數(shù)隨著樣本量的增加出現(xiàn)規(guī)律性的變化。觀測(cè)雜合度和預(yù)期雜合度兩個(gè)指標(biāo)值在樣本量90比樣本量10減少了26.12%和24.93%;有效等位基因數(shù)、平均等位基因數(shù)和多樣性指數(shù)隨著樣本量的增加呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，而且變化較大，分別為49.73%、36.67%和120.68%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，樣本量小于50時(shí)，參數(shù)值變化較大，多樣性指數(shù)變化了100.52%，平均等位基因數(shù)變化最小為23.37%。當(dāng)樣本量大于50時(shí)，參數(shù)值變化不大，變化最大為有效等位基因數(shù)19.43%，變化最小的是觀測(cè)雜合度和預(yù)期雜合度，分別為0.76%和1.29%。

表1 樣本大小對(duì)苧麻SSR遺傳參數(shù)的影響Tab.1 SSR parameter values under different sample sizes of ramie

用SAS軟件繪制遺傳多樣性參數(shù)隨樣本量變化的穩(wěn)定性曲線 (圖1)，結(jié)果顯示觀測(cè)雜合度、預(yù)期雜合度和多樣性指數(shù)在樣本量達(dá)到50后參數(shù)值變化較小。平均等位基因數(shù)的參數(shù)值在樣本量達(dá)到30時(shí)變化就比較平穩(wěn)。而有效等位基因數(shù)的參數(shù)值隨樣本量的變化呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。

圖1 苧麻SSR遺傳參數(shù)隨樣本大小的變化曲線Fig.1 Curve of SSR parameter values under different sample sizes of ramie

2.2 SRAP標(biāo)記抽樣樣本量與遺傳多樣性參數(shù)的關(guān)系

不同的分子標(biāo)記對(duì)同一作物居群的樣本量而獲得的遺傳多樣性參數(shù)值差異很大 ［8］。用SRAP標(biāo)記對(duì)不同樣本量所得到的遺傳多樣性參數(shù)分析結(jié)果表明，觀測(cè)雜合度和預(yù)期雜合度兩個(gè)指標(biāo)值在樣本量90比樣本量10分別減少了22.71%和17.82%。有效等位基因數(shù)、平均等位基因數(shù)和多樣性指數(shù)隨著樣本量的增加呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，分別增加了25.29%、10.49%和24.77%。而且當(dāng)樣本量小于60時(shí)，參數(shù)值變化較大，有效等位基因數(shù)和多樣性指數(shù)變化了23.10%和23.20%，平均等位基因數(shù)變化最小為6.83%。當(dāng)樣本量大于60時(shí)，參數(shù)值變化不大，均在5%以下 (表2)。

表2 樣本大小對(duì)苧麻SRAP遺傳參數(shù)的影響Tab.2 SRAP parameter values under different sample sizes of ramie

圖2 苧麻SRAP遺傳參數(shù)隨樣本大小的變化曲線Fig.2 Curve of SRAP parameter values under different sample sizes of ramie

用SAS軟件繪制遺傳多樣性參數(shù)隨樣本量變化的穩(wěn)定性曲線 (圖2)，結(jié)果顯示觀測(cè)雜合度、預(yù)期雜合度、有效等位基因數(shù)和多樣性指數(shù)在樣本量達(dá)到60后參數(shù)值變化較為平穩(wěn)。平均等位基因數(shù)的參數(shù)值在樣本量達(dá)到60以后仍有繼續(xù)增加的趨勢(shì)，但變化量較小。

3 討論

用SSR和SRAP兩種分子標(biāo)記分析抽樣樣本量與遺傳多樣性參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示群體抽樣樣本量對(duì)苧麻群體的遺傳多樣性參數(shù)值有不同程度的影響，對(duì)各遺傳多樣性參數(shù)影響并不一致，觀測(cè)雜合度、預(yù)期雜合度和多樣性指數(shù)在樣本量達(dá)到一定值后變化較為平穩(wěn)，有效等位基因數(shù)和平均等位基因數(shù)隨樣本量的增加變化規(guī)律不明顯，但變化幅度都相應(yīng)減少。

在SSR標(biāo)記中群體抽樣樣本量對(duì)苧麻群體遺傳多樣性參數(shù)值有很大的影響，樣本量小于50時(shí)，參數(shù)值變化幅度較大，當(dāng)樣本量大于50時(shí)，參數(shù)值變化不大，這說(shuō)明利用遺傳多樣性參數(shù)來(lái)衡量苧麻群體的遺傳多樣性水平，需要50個(gè)樣本以上。用SRAP標(biāo)記估算群體的遺傳多樣性所需的群體抽樣樣本量達(dá)到60個(gè)時(shí)才能較好地反應(yīng)總體的多樣性水平。

在本試驗(yàn)中從某些參數(shù)值可以看出，雖然用小的抽樣群體數(shù)量也可以估算遺傳多樣性參數(shù)值，但是小樣本很難代表該群體的總體遺傳多樣性，可能會(huì)過(guò)高估計(jì)抽樣群體的遺傳多樣性，并遺漏重要遺傳多樣性，此種抽樣群體的取樣策略與其他的研究結(jié)果相似［15－16］。

［1］劉強(qiáng)，高新學(xué)，劉鐵山，等.SRAP技術(shù)在水稻品種鑒定和純度檢測(cè)中的應(yīng)用研究［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(1):26－28.

［2］孟慶長(zhǎng)，陳艷萍，楊興華，等.利用SSR技術(shù)鑒定蘇玉20的純度［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25(3):508－512.

［3］朱美霞，李英芝，王建書(shū)，侯英梅，孟艷玲.利用SSR方法鑒定棉花品種純度［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005(11):2010－2016.

［4管志坤，羅雙霞，李艷霞，等.利用SSR標(biāo)記鑒定油綠3號(hào)大白菜品種純度 ［J］.種子，2011，30(09):34－35，39.

［5］關(guān)榮霞，劉燕，劉章雄，等.利用SSR方法鑒定大豆品種純度［J］.分子植物育種，2003，1(03):357－360.

［6］黎裕，王天宇，田松杰，等.利用分子標(biāo)記分析遺傳多樣性時(shí)的玉米群體取樣策略研究 ［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2003，4(4):314－317.

［7］金燕，盧寶榮.遺傳多樣性的取樣策略 ［J］.生物多樣性，2003，11(2):155－161.

［8］趙茹，程舟，陸偉峰，盧寶榮.基于分子標(biāo)記的野生大豆居群遺傳多樣性估算與取樣策略 ［J］.科學(xué)通報(bào)，2006，51(9):1042－1048.

［9］ Powell W，Machray G C，Provan J.Polymorphism revealed by simple sequence repeats.Trends Plant Sci，1996，1:215－222.

［10］ Xu Y，Ma R C，Xie H，Liu J T，Gao M Q.Development of SSR markers for the phylogenetic analysis of almond trees from China and the Mediterrancan region.Genome，2004，47:1091－1104.

［11］吳曉雷，賀超英，等.用SSR分子標(biāo)記研究大豆屬種間親緣進(jìn)化關(guān)系［J］.遺傳學(xué)報(bào)，2001，28(4):359－366.

［12］ M.Ferriol，B.Pico，F(xiàn).Nuez.Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers ［J］.Theor Appl Genet，2003，107(7):271 －282.

［13］王傳堂，張建成，楊新道，等.花生序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性 (SRAP)標(biāo)記的研究［J］.花生學(xué)報(bào)，2005，34(3):11－15.

［14］張建成，王傳堂，焦坤，楊新道.SRAP標(biāo)記技術(shù)在花生種子純度鑒定中的應(yīng)用［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21(12):35－39.

［15］ Lu B R.Conserving biodiversity of soybean gene pool in the bio－technology era［J］.Plant Species Biol，2004，19(11):115－125.

［16］ Raddi S，Sumer S.Genetic diversit in natural Cupreesus semper－virens L，populations in Turkey［J］ .Biochem System Ecol，1999，27(8):799－814.