譚龍濤，喻春明，陳平，王延周，陳繼康，溫嵐，熊和平

(中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，湖南長沙410205)

作物品種純度的快速、準確鑒定是作物品種資源保存、研究和利用過程中的一個重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的方法是依靠種子或植株的表型性狀來鑒別不同的個體，雖然該方法比較直觀、簡便，但由于可直接觀測的農(nóng)藝性狀十分有限，而且有些性狀要在特定的生育期才能檢測，因此表型性狀的檢測受到很大限制，對親緣關系較近的個體的檢測則尤為困難。分子標記技術做為作物品種純度鑒定的有效方法，現(xiàn)已廣泛應用于水稻［1］、玉米［2］、棉花［3］、白菜［4］、大豆［5］等植物 。但是在植物居群遺傳多樣性的研究中，還存在著遺傳多樣性參數(shù)種類的確定，樣本大小估測群體遺傳多樣性參數(shù)的可靠性等問題。

在遺傳多樣性比較過程中，選擇恰當?shù)倪z傳多樣性參數(shù)和有代表性的樣本量，使檢測到的遺傳多樣性及其估算的參數(shù)具有較高的可信性［6－7］。趙茹等對野生大豆居群遺傳多樣性估算與取樣策略的研究結果表明，不同分子標記檢測到同一野生大豆居群的各種遺傳參數(shù)值不同。同一居群中的不同樣本量對遺傳多樣性參數(shù)的估算值有較大的影響，當選用多態(tài)位點百分率 (P)時，30－45個植株才能代表總體90%以上的遺傳變異［8］。關于苧麻群體檢測樣本量的選擇，還沒有發(fā)現(xiàn)相關報道。

SSR標記具有共顯性、多態(tài)性相對豐富、基因組覆蓋較多等優(yōu)點［9］，而且該技術簡單快捷，穩(wěn)定性高?，F(xiàn)已廣泛應用于遺傳圖譜的構建、遺傳多樣性分析和系統(tǒng)學研究方面［10－11］。SRAP標記具有高效、簡便、重復性好、產(chǎn)率高、易測序、便于克隆目標片段的特點。目前已成功在作物遺傳多樣性分析、基因定位重要性狀的標記、比較基因組學、遺傳圖譜的構建以及相關基因的克隆等方面得到廣泛應用［12－14］。

本研究以中苧1號種子苗為研究材料，選取了31對SSR引物和48對SRAP引物進行分子標記，對苧麻品種的主要遺傳多樣性參數(shù)隨抽樣群體樣本量的變化規(guī)律進行系統(tǒng)研究，為苧麻群體遺傳多樣性研究的取樣策略提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為開放授粉中苧1號種子苗，栽培于中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所國家種質苧麻圃。

1.2 DNA的提取

由于苧麻葉中含有大量的酚類物質，為了獲得較高純度的基因組DNA，本試驗對CTAB法進行了改良，通過延長抽提時間和加抗氧化劑的方法提高純度。用BeckMan DU800分光光度計測定DNA的純度和濃度，并稀釋到約45ng/μL。

1.3 SSR和SRAP引物的來源

31對SSR引物和48對SRAP引物由中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所苧麻種質資源課題組提供。

1.4 PCR擴增和產(chǎn)物檢測

SSR反應體系每25μL體系中含有DNA模板為45ng，引物0.15μmol/L，Taq酶用量1.5U，dNTPs為0.15mmol/L。反應擴增程序為:95℃預變性5min，94℃變性1min，50、55或60℃(根據(jù)引物的退火溫度而定)復性50s，72℃延伸1min，30次循環(huán)后，72℃延伸5min。

SRAP反應體系為20μL，其中10×Tag buffer 2μL，dNTPs(5mmol/L)0.4μL，5’引物和3’引物 (0.1nm/μl)各0.6μL，Tag酶 (5U/μL)0.4μL，DNA 模板 2μL，加 ddH2O 至 20μL。反應擴增程序為:94℃預變性1min，94℃變性1min，33℃復性1min，72℃延伸1min，循環(huán)5次，然后94℃變性1min，55℃復性1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)，72℃最后延伸5min。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗從中苧1號種子苗群體中隨機選取100蔸，并從中隨機抽取10、20、30、40、50、60、70、80，90個個體組成抽樣群體，計算其遺傳多樣性參數(shù)，每個抽樣群體重復5次。分子標記結果采用人工讀帶的方法，將電泳圖上可重復的、清晰的條帶記為“1”，同一位置無帶記為“0”，條帶缺失數(shù)據(jù)記為“2”。用POPGENE2.0軟件對整理的數(shù)據(jù)進行分析，計算不同抽樣群體的遺傳多樣性參數(shù)的平均值，主要的遺傳多樣性參數(shù)有觀測雜合度 (Ho)，期望雜合度(He)，shannon遺傳多樣性指數(shù) (I)，遺傳有效等位基因數(shù)目 (Ne)和平均等位基因數(shù) (Na)。然后用SAS統(tǒng)計軟件對抽樣群體隨樣本量的增加遺傳多樣性水平變化趨勢進行擬合分析。

2 結果與分析

2.1 SSR標記抽樣樣本量與遺傳多樣性參數(shù)的關系

表1顯示了遺傳多樣性參數(shù)隨著樣本量的增加出現(xiàn)規(guī)律性的變化。觀測雜合度和預期雜合度兩個指標值在樣本量90比樣本量10減少了26.12%和24.93%;有效等位基因數(shù)、平均等位基因數(shù)和多樣性指數(shù)隨著樣本量的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，而且變化較大，分別為49.73%、36.67%和120.68%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，樣本量小于50時，參數(shù)值變化較大，多樣性指數(shù)變化了100.52%，平均等位基因數(shù)變化最小為23.37%。當樣本量大于50時，參數(shù)值變化不大，變化最大為有效等位基因數(shù)19.43%，變化最小的是觀測雜合度和預期雜合度，分別為0.76%和1.29%。

表1 樣本大小對苧麻SSR遺傳參數(shù)的影響Tab.1 SSR parameter values under different sample sizes of ramie

用SAS軟件繪制遺傳多樣性參數(shù)隨樣本量變化的穩(wěn)定性曲線 (圖1)，結果顯示觀測雜合度、預期雜合度和多樣性指數(shù)在樣本量達到50后參數(shù)值變化較小。平均等位基因數(shù)的參數(shù)值在樣本量達到30時變化就比較平穩(wěn)。而有效等位基因數(shù)的參數(shù)值隨樣本量的變化呈現(xiàn)增加的趨勢。

圖1 苧麻SSR遺傳參數(shù)隨樣本大小的變化曲線Fig.1 Curve of SSR parameter values under different sample sizes of ramie

2.2 SRAP標記抽樣樣本量與遺傳多樣性參數(shù)的關系

不同的分子標記對同一作物居群的樣本量而獲得的遺傳多樣性參數(shù)值差異很大 ［8］。用SRAP標記對不同樣本量所得到的遺傳多樣性參數(shù)分析結果表明，觀測雜合度和預期雜合度兩個指標值在樣本量90比樣本量10分別減少了22.71%和17.82%。有效等位基因數(shù)、平均等位基因數(shù)和多樣性指數(shù)隨著樣本量的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，分別增加了25.29%、10.49%和24.77%。而且當樣本量小于60時，參數(shù)值變化較大，有效等位基因數(shù)和多樣性指數(shù)變化了23.10%和23.20%，平均等位基因數(shù)變化最小為6.83%。當樣本量大于60時，參數(shù)值變化不大，均在5%以下 (表2)。

表2 樣本大小對苧麻SRAP遺傳參數(shù)的影響Tab.2 SRAP parameter values under different sample sizes of ramie

圖2 苧麻SRAP遺傳參數(shù)隨樣本大小的變化曲線Fig.2 Curve of SRAP parameter values under different sample sizes of ramie

用SAS軟件繪制遺傳多樣性參數(shù)隨樣本量變化的穩(wěn)定性曲線 (圖2)，結果顯示觀測雜合度、預期雜合度、有效等位基因數(shù)和多樣性指數(shù)在樣本量達到60后參數(shù)值變化較為平穩(wěn)。平均等位基因數(shù)的參數(shù)值在樣本量達到60以后仍有繼續(xù)增加的趨勢，但變化量較小。

3 討論

用SSR和SRAP兩種分子標記分析抽樣樣本量與遺傳多樣性參數(shù)的關系，結果顯示群體抽樣樣本量對苧麻群體的遺傳多樣性參數(shù)值有不同程度的影響，對各遺傳多樣性參數(shù)影響并不一致，觀測雜合度、預期雜合度和多樣性指數(shù)在樣本量達到一定值后變化較為平穩(wěn)，有效等位基因數(shù)和平均等位基因數(shù)隨樣本量的增加變化規(guī)律不明顯，但變化幅度都相應減少。

在SSR標記中群體抽樣樣本量對苧麻群體遺傳多樣性參數(shù)值有很大的影響，樣本量小于50時，參數(shù)值變化幅度較大，當樣本量大于50時，參數(shù)值變化不大，這說明利用遺傳多樣性參數(shù)來衡量苧麻群體的遺傳多樣性水平，需要50個樣本以上。用SRAP標記估算群體的遺傳多樣性所需的群體抽樣樣本量達到60個時才能較好地反應總體的多樣性水平。

在本試驗中從某些參數(shù)值可以看出，雖然用小的抽樣群體數(shù)量也可以估算遺傳多樣性參數(shù)值，但是小樣本很難代表該群體的總體遺傳多樣性，可能會過高估計抽樣群體的遺傳多樣性，并遺漏重要遺傳多樣性，此種抽樣群體的取樣策略與其他的研究結果相似［15－16］。

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