吳建忠，趙東升，黃文功，劉巖，于瑩，姜衛(wèi)東，趙茜，康慶華，程莉莉，袁紅梅，吳廣文，關(guān)鳳芝*

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱150086)

1 前言

亞麻(Linum usitatissmum L.)是亞麻科(Linaceae)亞麻屬(Linum)的一年生自花授粉草本纖維植物，已經(jīng)有六七千年的栽培歷史。亞麻是重要的經(jīng)濟(jì)作物，它既是當(dāng)今世界第三大纖維作物，又是五大油料作物之一。我國亞麻資源豐富，大多栽培品種難以從形態(tài)上區(qū)分開，而亞麻資源是育種和生產(chǎn)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，因此需要建立一種簡單、快速的鑒定方法。分子標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用為亞麻的品種鑒定及品種的親緣關(guān)系分析提供了有效途徑。

SRAP(sequence－related amplified polymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性)是目前比較理想的一種新型分子標(biāo)記，與其他分子標(biāo)記(RFLP、AFLP、SSR等)相比，具有技術(shù)簡便 、快速高效 、費(fèi)用低、污染小、共顯性好、信息量豐富等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于多種動(dòng)植物的遺傳多樣性分析 、種質(zhì)鑒定、遺傳連鎖圖構(gòu)建和比較基因組學(xué)等方面［1］。本試驗(yàn)采用SRAP技術(shù)，對12個(gè)亞麻品種的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，以確定各個(gè)亞麻品種之間的遺傳差異，為資源利用和亞麻遺傳連鎖圖譜構(gòu)建中親本選配及選育提供分子生物學(xué)依據(jù)，同時(shí)對新引進(jìn)品種SUZANNE的油纖用類型鑒定提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

供試的12份亞麻品種中有纖用亞麻9個(gè)，油用亞麻2個(gè)，未知類型1份，詳細(xì)情況分別見表1。

表1 供試亞麻品種及來源Tab.1 The tested flax varieties and their origins

2.2 方法

2.2.1 DNA提取和濃度測定

采用已改進(jìn)的CTAB法提取亞麻基因組DNA［2］。紫外分光光度計(jì)檢測DNA的濃度和純度，置20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 SRAP反應(yīng)體系

SRAP反應(yīng)采用已經(jīng)優(yōu)化好的體系［3］，在20ul反應(yīng)體系中模板75ng，25 ng/μL的上下游引物用量為70ng，Mg2+濃 度 為1.5mmol/L，dNTP濃 度 為0.40mmol/L，1.5U 的 TaqDNA 聚合酶。

2.2.3 PCR擴(kuò)增條件

反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min、35℃復(fù)性1 min、72℃延伸1 min、5次循環(huán);94℃變性1 min、50℃復(fù)性1 min、72℃延伸1 min、循環(huán)35次;最后72℃延伸10 min;4℃保溫20 h。

2.2.4 PCR產(chǎn)物的檢測

用2%的瓊脂糖凝膠分離SRAP的擴(kuò)增產(chǎn)物，使用20W恒功率電泳1h，凝膠成像儀照相。

2.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對清晰可辯的電泳條帶全部采用人工讀帶的方式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，按擴(kuò)增條帶有無記數(shù)，在相同的遷移位置上，當(dāng)某一擴(kuò)增帶出現(xiàn)時(shí)，賦值為“1”，無帶賦值為“0”，從而把圖形資料轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)資料。根據(jù)Nei－li相似系數(shù)法(也稱為Dice法)求得品種i和j之間得相似系數(shù)Sij:

其中 Ni表示品種i中的條帶數(shù)目;Nj表示品種j的條帶數(shù)目;Nij表示品種 i，j共有的條帶數(shù)目。采用分析軟件NTSYS對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳相似性分析，據(jù)各材料間的遺傳相似性系數(shù)用非加權(quán)類平均聚類方法(UPGMA)對其進(jìn)行聚類分析［4］。

3 結(jié)果與分析

3.1 引物多態(tài)性篩選

選取對供試亞麻材料可以擴(kuò)增出特異性譜帶且重復(fù)性好的9對有效引物，見表2。

表2 用于SRAP分析的19對有效引物序列Tab.2 The sequences of 19 pairs of SRAP primers

3.2 亞麻SRAP擴(kuò)增結(jié)果

3.2.1 DNA多態(tài)性分析

9對引物在12個(gè)亞麻品種中共擴(kuò)增出1701條清晰穩(wěn)定的條帶(見表3)，其中593條為特異性條帶，平均每對引物擴(kuò)增出189條帶，平均每對引物擴(kuò)增出65.9條特異性條帶，其多態(tài)率為34.9%。用2%的瓊脂糖凝膠分離SRAP的擴(kuò)增產(chǎn)物，多態(tài)性條帶非常清晰，容易辨別。每對引物在12個(gè)亞麻材料中共可擴(kuò)

，達(dá)225條(增出的條帶數(shù)在124－225條之間，平均為189條。其中擴(kuò)增出條帶數(shù)最多的為 M2見圖1)。

組合、擴(kuò)增總帶plified and poly表3 SRAP引物 數(shù)及多態(tài)性帶數(shù)Tab.3 Total ammorphic fragment numbers and their according SRAP primers

圖1 2%瓊脂糖凝膠電泳分離12個(gè)亞麻品種的M2引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplified bands of 12 flax varieties with M2 primers and separated by 2%agarose gel electrophoresis

3.2.2 亞麻品種的聚類分析

對12個(gè)亞麻品種的SRAP分析結(jié)果進(jìn)行UPGMA聚類(圖2)，在遺傳距離0.53時(shí)，可將12份材料分為三大類群，第Ⅰ大類包含:黑亞14號(hào)、雙亞8號(hào)、SUZANNE、A220和H113，其中黑亞14號(hào)和雙亞8號(hào)、A220和H113又各聚在一起，表明新引進(jìn)品種SUZANNE與纖用亞麻有一定的親緣關(guān)系，但和黑亞8號(hào)、黑亞14號(hào)又存在一定的差異度，因此可認(rèn)為SUZANNE是一種新的纖維用亞麻品種;第Ⅱ大類中纖維用亞麻品種AGATHA、DIANE、ARIANE和黑亞20號(hào)聚在一起，表明這些材料親緣關(guān)系較近;第Ⅲ大類將油用亞麻壩亞11號(hào)和寧亞17號(hào)聚在一起，且與YCH聚為一類，表明該類材料具有油用亞麻特性，可認(rèn)為本類品種為油用亞麻或具有油用開發(fā)的潛力。

圖2 基于UPGMA法構(gòu)建的12個(gè)亞麻品種聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram of 12 flax varieties by UPGMA method

從聚類分析結(jié)果可以看出，纖用、油用亞麻各自聚類，表明它們之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。故在品種間雜種優(yōu)勢利用時(shí)可以將纖用亞麻和油用亞麻作為親本可以選育出理想的新型亞麻品種。同時(shí)，新引進(jìn)品種SUZANNE和黑亞14號(hào)、雙亞8號(hào)等纖維用亞麻的遺傳距離較近，因此有理由認(rèn)為SUZANNE是一纖維用品種，且其具有高纖開發(fā)的潛力，適合在雜種優(yōu)勢利用中作為高纖親本進(jìn)行選育。

4 討論

本研究通過對12個(gè)不同亞麻品種進(jìn)行SRAP分析，9對引物共擴(kuò)增出593條多態(tài)性帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出65.9條多態(tài)性帶，其多態(tài)率為34.9%。用UPMGA法建立了12個(gè)亞麻品種的親緣關(guān)系聚類圖，以遺傳距離0.53為閾值可將12個(gè)亞麻品種分為3組，油纖用品種各自成類，這就為新引進(jìn)品種SUZANNE的類型劃分提供了有力依據(jù)。本研究聚類分析的結(jié)果與品種的油纖用途類型基本吻合，充分證實(shí)了SRAP用于品種間遺傳變異性分析的可行性，同時(shí)品種資源的遺傳多樣性研究不僅可以為新品種選育策略的制訂提供依據(jù)，還可以為親本選配、后代遺傳變異程度及雜種優(yōu)勢水平的預(yù)測提供預(yù)見性指導(dǎo)。利用聚類分析結(jié)果可以快速、有效的進(jìn)行親本選配，減少盲目性，這對亞麻新品種的選育和雜交優(yōu)勢的利用具有很重要的意義。-本試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了SRAP標(biāo)記的確具有引物設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)操作過程簡單、擴(kuò)增譜帶清晰、多態(tài)性好和結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，為此。筆者下一步將繼續(xù)利用SRAP技術(shù)對亞麻種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析以及纖維含量、出麻率等重要性狀進(jìn)行研究，旨在為亞麻種質(zhì)材料篩選和新品種選育起到更多的輔助作用。

［1］Agarwal M ，Shrivastava N ，Padh H.Advances inmolecular marker techniques and their applications in plantsciences［J］.Plant Cell Reports，2008，27(4):617－631.

［2］吳建忠.亞麻全基因組DNA的提取及分析［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(07):18－19.

［3］吳建忠，黃文功，等.亞麻SRAP反應(yīng)體系的優(yōu)化和多態(tài)性標(biāo)記篩選［J］.中國麻業(yè)科學(xué)，2011(06):281－284.

［4］Nei M，Li WH.Mathematical model for studyinggenetic variation in terms ofrestriction endonucleases［J］ .Proceedings ofthe National AcademyofSciences，1979，76:5269－5273.