王彤彤 張淑江 章時蕃 李 菲 張 慧 孫日飛

（中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

大白菜根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）侵染引起的世界性土傳病害，目前在很多國家都發(fā)生已久且普遍嚴重（楊永林，1990）。病原菌專性寄生于蕓薹屬等十字花科作物的根部，其休眠孢子可在土壤中存活長達8 a甚至以上（Wallenhammar，1996），主要為害根部，侵染后導致根部細胞異常分裂和膨大，形成腫瘤，造成根的正常生理機能受阻，植株缺乏養(yǎng)分而生長遲緩，枯萎落葉直至死亡。苗期和成株期均可以被感染，田間土壤一旦受到根腫病菌污染，將長期帶菌，從而不再適合種植十字花科作物（孫保亞 等，2005）。近年來我國大白菜根腫病發(fā)病面積急劇增加，造成嚴重危害。培育抗根腫病品種是保證大白菜正常生產(chǎn)的重要措施，而利用分子標記輔助選擇育種是經(jīng)濟有效的途徑之一。

InDel（Insertion-deletion Length Polymorphism）標記是在等位基因位點上一定數(shù)量的核苷酸插入或缺失一段相對短的核苷酸序列而產(chǎn)生的長度多態(tài)性變異（Jander et al.，2002），是基于全基因組測序的第三代分子標記，具有標記特異性高、穩(wěn)定性好、檢測方法簡單、經(jīng)濟等優(yōu)點。這種新型標記的使用可大大增加白菜類作物中基于基因組序列的特異性分子標記數(shù)量。本試驗在實驗室已有的大量InDel標記的基礎(chǔ)上，構(gòu)建F2分離群體，利用分離群體分組分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA）篩選與抗根腫病基因緊密連鎖的InDel標記，從而為分子標記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試大白菜材料由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所白菜課題組提供。利用高抗根腫病的材料F1金錦2號（編號A00645）和奈斯高（編號A00647）自交，分別構(gòu)建包含197個和207個單株的F2群體，通過根腫菌接種鑒定進行抗性遺傳分析，以大白菜品種黃美春作為感病對照。接種所用根腫病菌由本所菜病綜防課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 根腫菌接種方法 人工接種采用普通菌土法（李妍 等，2011），接種量為 1 g滅菌土含0.05 g腫根，取適量帶有根腫菌的病根用組織打碎機打成勻漿，過濾，靜置2 h，使游動孢子從孢子囊中充分釋放。而后按照一定比例加水和滅菌土充分混合，制成孢子含量為8×106個·g-1（干土）的菌土，播種土全部為菌土。

1.2.2 根腫病抗性鑒定 2010年12月12日，將A00645、A00647和感病對照黃美春各15粒種子，兩個F2群體各選197粒和207粒種子，經(jīng)催芽后播種于裝有菌土的苗缽中。土壤保持濕潤，溫度不低于 17 ℃。于 2011年 3月 10日洗凈根部泥土，按 0～7級標準調(diào)查單株發(fā)病情況，0級：根系正常，無病害；1級：主根未發(fā)生病害，須根、側(cè)根有個別細小根瘤；3級：主根出現(xiàn)病害癥狀但腫大不明顯，須根、側(cè)根較多根瘤或根瘤直徑或長度超過0.5 cm；5級：主根腫大明顯，腫大部分直徑為莖基的2～3倍，大部分須根、側(cè)根有腫瘤；7級：主根腫大明顯，腫大部分直徑為莖基的3倍以上。0、1級為抗病，3、5、7級為感病。接種鑒定試驗在本所菜病綜防課題組溫室進行。病情指數(shù)（DI）計算方法為：

病情指數(shù)=〔Σ（各級病株數(shù)×相應級別值）/（調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最高級別代表值）〕×100

其中病情指數(shù)＜10為抗病，病情指數(shù)≥10為感病。

1.2.3 基因組DNA提取及建池 采集大白菜單株葉片，凍干磨成粉末。采用改良CTAB法對凍干樣品提取基因組DNA（Wang et al.，2005），用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，并用Nanodrop ND1000（Gene Company Limited，China）檢測DNA濃度及純度。根據(jù)所測濃度，將單株 DNA濃度稀釋至50 ng·μL-1。利用BSA法（Michelmore et al., 1991），根據(jù)F2群體接種鑒定結(jié)果選取10株高抗單株構(gòu)建抗病池，10株高感單株構(gòu)建感病池。

1.2.4 InDel反應體系建立和引物篩選 本試驗中InDel標記反應體系的建立，主要對PCR反應體系中幾個核心影響因素進行優(yōu)化組合，從而確定出最佳的PCR反應體系。均采用20 μL標準反應體系：50 ng·μL-1基因組 DNA 5 μL，10×PCR buffer（含 Mg2+）2 μL，10 mmol·L-1dNTPs 1.6 μL，2.5 U·μL-1Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，5 μmol·L-1正、反向引物各 0.4 μL，用 ddH2O調(diào)整體系終體積為20 μL。PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，16 ℃保存。PCR產(chǎn)物加入5 μL非變性雙色緩沖液，利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳恒壓120 V，0.5×TBE為緩沖液。利用快速銀染法染色（Sanguinetti et al.，1994），照相保存。統(tǒng)計多態(tài)性條帶，并把存在多態(tài)性條帶的引物再次在抗性池中擴增，驗證多態(tài)性。

1.2.5 多態(tài)性標記在群體中的驗證及繪制遺傳連鎖圖譜 將在抗感病池中表現(xiàn)多態(tài)的標記在 F2分離群體中進行驗證，檢測標記在群體中的多態(tài)性。統(tǒng)計帶型，利用JoinMap4.0軟件分析目的基因和分子標記位點的連鎖關(guān)系，選擇最小LOD閾值2.0構(gòu)建連鎖圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜根腫病抗性遺傳分析

F1（A00645）為高抗，自交后代 F2群體（A00645-4）197個單株經(jīng)過根腫菌接種鑒定，得到156個抗病單株和41個感病單株。經(jīng)卡方檢測，符合3∶1的孟德爾遺傳分離比例（χ2=1.63＜=3.84），說明該材料中根腫病抗性為單基因顯性遺傳，該性狀可以按照質(zhì)量性狀進行分析；F1A00647表現(xiàn)高抗，自交后代 F2群體（A00647-3）207個單株經(jīng)根腫菌接種鑒定，得到165個抗病單株和42個感病單株。經(jīng)卡方檢測，也符合3∶1的分離比（χ2=2.20＜=3.84），說明該材料中根腫病抗性也是由顯性單基因控制。

2.2 InDel標記篩選

利用A00645-4群體構(gòu)建抗感病池，篩選了720對InDel引物，其中12對引物擴增出了多態(tài)性片段。進一步將這12對引物進行F2群體單株驗證，結(jié)果得到9個與抗根腫病基因連鎖的InDel標記，分別為 BrID10867，BrID11233，BrID11509，BrID11507，BrID10781，BrID11683，BrID90269，BrID11689，BrID10353（表 1）。

2.3 遺傳連鎖分析

在 197個單株的 F2群體 A00645-4中驗證 9個標記的多態(tài)性（圖 1）。統(tǒng)計數(shù)據(jù)后，利用JoinMap 4.0軟件，LOD閾值5.0，分析數(shù)據(jù)并繪制遺傳連鎖圖。其中，BrID90269和BrID11683距離抗根腫病基因最近，分別為2.0 cM和2.5 cM，BrID10353距離抗病基因最遠，為16.2 cM（圖 2）。

2.4 大白菜抗根腫病基因的定位

9個InDel連鎖標記均位于大白菜連鎖群A8上。其中BrID90269、BrID 11683和 BrID11689均位于 A8連鎖群的Scaffold 10上，因此確定該根腫病抗性基因CR位于Scaffold10上（圖2）。根據(jù)大白菜基因組測序結(jié)果以及抗病基因保守結(jié)構(gòu)域在白菜基因組上的基因注釋，標記BrID90269和BrID11683之間的區(qū)域內(nèi)預測有6個抗病基因，并且這些抗病基因成簇分布。

表1 與抗根腫病基因連鎖的InDel標記信息

圖1 InDel標記在抗感病池和單株中的擴增圖譜

圖2 遺傳連鎖圖

3 討論

本試驗通過 InDel標記 BrID90269和BrID11683將抗根腫病基因 CR定位在大白菜連鎖群A8上，具體是在Scaffold10上一個大于1450 kb的區(qū)間內(nèi)。目前報道的抗根腫病基因中，CRa（Matsumoto et al.，1998；Hayashida et al.，2008），CRb（Piao et al.，2004），Crr3（Hirai et al.，2004），CRk（Sakanoto et al.，2008）皆位于A3上，Crr2和Crr4（Suwabe et al.，2006）分別位于A1和A6上，CRc（Sakanoto et al.，2008）位于 A2 上，只有 Crr1（Suwabe et al.，2003）位于A8上。但是與Crr1緊密連鎖的SSR標記BRMS-088在本試驗所用材料擴增后沒有多態(tài)性。將BRMS-088標記引物序列與白菜基因組比對后發(fā)現(xiàn)，該標記位于 A8的Scaffold 97上，兩個基因不在染色體的同一區(qū)域，因此初步認為本試驗定位的抗病基因 CR和Crr1可能不是同一位點。根據(jù)大白菜測序結(jié)果以及抗病基因保守結(jié)構(gòu)域在白菜基因組上的基因注釋，在所定位的Scaffold10的區(qū)間內(nèi)預測有6個抗病基因，且成簇分布。本試驗結(jié)果有助于抗根腫病基因的精細定位以及進一步的克隆，并且所得到的緊密連鎖InDel標記可用于分子標記輔助選擇育種，加速培育大白菜抗根腫病優(yōu)良品種。

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