鄒 敏 唐佳佳 宋洪元

（南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶市蔬菜學重點實驗室，西南大學園藝園林學院，重慶 400715）

Napin蛋白是蕓薹屬植物中廣泛存在的一類由多基因編碼的種子貯藏蛋白，為種子發(fā)芽和幼苗生長提供氮源，在ABA的影響下，以組織特異性的方式表達形成（熊興華 等，2003）。利用油菜種子特異啟動子 Napin將目的基因集中在種子中表達，可實現(xiàn)目的基因在轉基因植株中的定時、定點調控，減少在其他組織中表達造成的能量浪費，并可避免在植株整體表達時可能帶來的生理代謝活動紊亂。目前，已從多個油菜品種中克隆了Napin啟動子（李麗 等，2001；劉建民 等，2008），并將其用于油料種子中脂肪酸的改良。Tan等（2011）利用Napin A啟動子介導BnLEC1和BnL1L基因在油菜籽中特異表達，使種子含油量從2%提升到20%。也有報道稱，由Napin啟動子驅動抗毒素基因在油菜籽中表達可以提高植株自身抵御病蟲害的能力（Husken et al.，2005）。除十字花科外，Napin啟動子控制外源基因的表達在煙草中也表現(xiàn)出了種子特異性（肖娜 等，2008；Swarnalatha et al.，2010）。

芥菜〔Brassica juncea（L.）Czern.et Coss.〕為蕓薹屬一年生或兩年生草本植物，是我國著名的特產蔬菜，通過種子繁殖。因此，獲得高質量的種子對芥菜種子發(fā)芽、幼苗生長及增強植株抗病抗逆性等均有重要意義。本試驗對油菜種子特異啟動子 Napin控制外源基因在芥菜中的表達特性進行研究，以增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因作為報告基因，將其置于來自油菜的Napin啟動子的調控之下，通過根癌農桿菌介導法轉入芥菜，分析其在轉基因植株種子及 T1代幼苗中的表達情況，以期為今后芥菜種子質量的改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為渝豐榨菜種子，購于重慶市三千種業(yè)有限公司。含有植物表達載體pCANapEGFP質粒（圖1）的根癌農桿菌EHA105由南方山地園藝學教育部重點實驗室構建及保存；Taq DNA聚合酶、DNA marker等購自北京全式金生物工程有限公司；抗生素卡那霉素（Kan）、鏈霉素（Str）、羧芐青霉素（Carb）等購自上海生工生物工程技術服務有限公司；除草劑 Basta（有效成分為PPT，草丁膦）購于日本化學工業(yè)株式會社；NAA、6-BA、乙醇、0.1%升汞等為國產試劑。

圖1 pCANapEGFP表達載體示意圖

1.2 方法

1.2.1 芥菜轉化 PPT篩選濃度確定 芥菜無菌苗的獲得參照曹必好等（2003）的方法進行，切取苗齡7 d的渝豐榨菜子葉和下胚軸，分別在MS+2 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+3%蔗糖+0.6%瓊脂的分化培養(yǎng)基中預培養(yǎng)（子葉預培養(yǎng)2 d，下胚軸預培養(yǎng)14 d至始分化），然后轉至分別添加0、2、4、6、8 mg·L-1PPT的分化培養(yǎng)基中，3次重復，每次重復15個子葉或下胚軸，14 d后統(tǒng)計各濃度PPT下芥菜子葉及下胚軸的成活率，確定PPT篩選的最佳濃度。

1.2.2 根癌農桿菌介導的芥菜轉化 參照曹必好等（2003）的方法進行并作了適當修改：以苗齡7 d的渝豐榨菜下胚軸作為農桿菌介導轉化的外植體，以MS+2 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+3%蔗糖+0.6%瓊脂為分化培養(yǎng)基，預培養(yǎng)和共培養(yǎng)各2 d，農桿菌濃度OD600為0.5～0.6，浸菌10 min。篩選培養(yǎng)基為MS+2 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+8 mg·L-1PPT+400 mg·L-1Carb+3%蔗糖+0.6%瓊脂；生根培養(yǎng)基為MS+0.2 mg·L-1NAA+8 mg·L-1PPT+400 mg·L-1Carb+3%蔗糖+ 0.6%瓊脂。

1.2.3 轉基因芥菜植株總 DNA的提取及 PCR鑒定 轉基因芥菜葉片總DNA的提取參照王關林和方宏筠（2002）的 CTAB法。PCR擴增用Napin啟動子的上游引物和EGFP報告基因的下游引物，Nap-F：5＇-CAAGCTTCTCTCATC CCCTTTTAAACCAAC-3＇；pGFP-2：5＇-TTAC TTGTACAGCTCG TCCATGCCG-3＇。擴增條件為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 40 s，56 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1 min 40 s，循環(huán) 30 次；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.4 轉基因芥菜中EGFP的表達檢測 分別取轉基因植株開花后15、25、35 d和完熟的種子（圖2）做徒手切片，在熒光顯微鏡（LEICA CTR5000）下分別觀察種皮、子葉和胚根3個部位，進行EGFP的表達檢測；轉基因T1代種子萌芽過程中，分別取根、下胚軸和子葉進行熒光表達檢測。

圖2 不同發(fā)育階段的轉基因芥菜種莢

2 結果與分析

2.1 PPT濃度對芥菜離體子葉及下胚軸生長的影響

除草劑Basta對植株再生有很強的抑制作用，在基因轉化過程中獲得抗性芽的關鍵是使用合適的篩選壓：除草劑濃度過高，對轉化細胞造成強烈的毒害作用，致使大量外植體在篩選培養(yǎng)基上很快死亡；濃度太低，對抗性芽不能進行嚴格篩選，會產生假抗性芽和大量嵌合體（楊廣東 等，2002；李鵬 等，2008）。從表1可以看出，PPT對芥菜離體子葉及下胚軸的分化均有抑制作用，PPT濃度為2 mg·L-1的分化培養(yǎng)基中子葉的成活率僅64.4%，下胚軸的成活率為37.8%；隨著PPT濃度的升高，子葉和下胚軸的成活率均急劇下降，在PPT濃度為8 mg·L-1時子葉和下胚軸全部死亡。因此，在篩選培養(yǎng)基中添加濃度為8 mg·L-1的PPT可對轉基因芽體進行有效篩選。

表1 PPT濃度對芥菜離體子葉和下胚軸生長的影響

2.2 轉基因芥菜植株的獲得及PCR檢測

農桿菌介導轉化芥菜下胚軸，經多次繼代培養(yǎng)，篩選出抗性芽（圖 3-a），將其切下置于生根培養(yǎng)基上生根（圖 3-b），以獲得抗性植株。對所獲得的4株抗性植株幼葉提取總基因組 DNA，并用 Nap-F和 pGFP-2引物擴增Napin啟動子和EGFP報告基因區(qū)域，結果均擴增出預期 1.1 kb大小的片段（圖 4），證明所得抗性植株均為轉基因植株。

圖3 農桿菌介導轉化芥菜下胚軸的植株再生過程

2.3 Napin-EGFP融合基因在轉基因芥菜中的表達特性

2.3.1 轉基因植株種子的熒光檢測 在開花后15 d的芥菜種子種皮中不能檢測到綠色熒光（圖 5-a），而胚根和子葉中已能檢測到綠色熒光（圖 5-e、i），且以胚根根尖的綠色熒光最強（圖 5-e）。隨著種子發(fā)育，在開花后25 d的種子種皮中能檢測出明顯的綠色熒光（圖5-b），隨著種子繼續(xù)發(fā)育，種皮、胚根和子葉中的綠色熒光均逐漸增強（圖 5-c、d、f、g、h、j、k、l），至種子完熟時，各部位綠色熒光最強（圖 5-d、h、l）。由此可見，Napin控制外源 EGFP基因在種皮、子葉、胚根中均有表達，且從種子發(fā)育的某個時期開始直到種子完熟，但在種皮中的表達滯后于在子葉和胚根中的表達。

2.3.2 轉基因 T1代種子萌發(fā)過程中各部位的熒光檢測 種子萌動時，芥菜胚根和子葉均能檢測到強的綠色熒光（圖6-a、b）；約1 d后，子葉展開，在幼苗下胚軸和根中仍能檢測到綠色熒光，但下胚軸的熒光強度強于根中的熒光強度（圖6-c、d）；至幼苗子葉轉綠（約2 d），已檢測不出下胚軸中的綠色熒光（圖6-e）；隨著幼苗生長至1片真葉期（約14 d），根中的綠色熒光也消失（圖6-f）。由此可見，在種子萌發(fā)過程中EGFP基因的表達量沒有增加，即Napin啟動子在該階段并沒有啟動下游基因的表達。

圖4 轉基因芥菜中Napin啟動子的鑒定

圖5 轉基因芥菜種子各部位的EGFP表達情況

圖6 轉基因T1代種子萌動至幼苗1片真葉期EGFP表達情況

3 結論與討論

本試驗將從油菜中克隆的種子特異啟動子 Napin與報告基因（增強型綠色熒光蛋白基因，EGFP）融合，通過根癌農桿菌介導轉入芥菜，經PPT篩選抗性植株，經鑒定所得抗性植株全為轉基因植株。通過對轉基因芥菜種子及 T1代幼苗進行熒光檢測，表明 Napin啟動子驅動外源EGFP基因在轉基因芥菜種子子葉、胚根、種皮中均有表達，且隨著種子逐漸成熟，種子各部位綠色熒光逐漸增強；在T1代幼苗中的表達僅在種子萌發(fā)初期的子葉、下胚軸和胚根中存在，至植株生長至1片真葉期時，各部位綠色熒光全部消失。

出現(xiàn)這種結果的原因可能是 Napin啟動子驅動基因的表達與種子發(fā)育階段具有明顯的關聯(lián)性。Napin啟動子控制外源基因在芥菜中的表達從種子發(fā)育的某個時期開始，直到種子完熟，因此在T1代幼苗生長初期仍存在大量的外源基因表達產物，隨著植株日漸長大，產物相對濃度降低，直至檢測不到。這與Murphy等（1989）認為Napin蛋白在油菜中的積累從種子發(fā)育中期開始直到種子完熟變干的結論相似。這也表明 Napin啟動子控制外源基因的表達與該蛋白本身的表達特性相關，且在屬內差異不大。本試驗結果對 Napin啟動子在植物，尤其是蕓薹屬植物中的應用提供依據，將該啟動子用于調控脂肪酸改良、抗病蟲等基因，可為優(yōu)良種子的生產提供參考。

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