劉 品, 趙萬千, 史團省, 沙琰琰, 張志杰, 朱 墨

(鄭州大學(xué) 生物工程系 生物多樣性與生態(tài)學(xué)研究所 河南 鄭州 450001)

0 引言

通過基因工程手段改良油菜的產(chǎn)量、品質(zhì)及抗逆性，建立良好的油菜轉(zhuǎn)化體系至關(guān)重要.油菜的遺傳轉(zhuǎn)化始于20世紀80年代后期，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)培育出抗病[1]、抗蟲、抗除草劑及品質(zhì)改良[2]的轉(zhuǎn)基因材料.

2004年文獻[3]第一次克隆了WIN1基因,目的是通過基因工程技術(shù)將SHN1/WIN1基因插入甘藍型油菜中油821，使其角質(zhì)膜厚度和成分有所改變，主要是防止自身體內(nèi)水分過度蒸騰散失，保持體內(nèi)水分的平衡[4-5],以此來提高油菜的抗旱、抗寒和抗病等性能，為提高油菜抗逆性，特別是為抗旱和抗寒性育種奠定基礎(chǔ).該項研究不僅對認識和揭示植物角質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)功能具有重要理論意義，而且對應(yīng)用植物基因工程技術(shù)改良和培育抗逆性強的作物優(yōu)良品種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)都具有重要的應(yīng)用價值[6-7].

本研究以甘藍型油菜中油821為實驗材料，對影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化效率的主要因素進行了探討，采用根癌農(nóng)桿菌方法將控制角質(zhì)膜厚度和成分的SHN1/WIN1基因轉(zhuǎn)化到甘藍型油菜中，目的是防止油菜自身體內(nèi)水分過度蒸騰散失，保持體內(nèi)水分的平衡,提高油菜抗旱、抗寒和抗病能力，提高油菜抗逆性.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1植物材料 試驗材料為甘藍型油菜中油821，種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所饋贈.播種出苗后，取苗齡為4～5 d的無菌葉柄作為轉(zhuǎn)化外植體.

1.1.2菌株和質(zhì)粒 植物表達載體PBI121-SHN1/WIN1和根癌農(nóng)桿菌均由鄭州大學(xué)生物工程系植物生理與營養(yǎng)實驗室構(gòu)建和保存.植物表達載體PBI121-SHN1/WIN1帶有NptII抗Kan基因[8].

1.1.3培養(yǎng)基 試驗所用培養(yǎng)基主要有以下幾種：

YEB培養(yǎng)基：牛肉膏(5 g/L),酵母抽提物(1 g/L),蛋白胨(5 g/L),蔗糖(5 g/L),MgSO4(2 mmol/L)，pH 7.2，固體培養(yǎng)基含瓊脂15 g/L.

重懸培養(yǎng)基：1/2(MS)+1 mg/L(2,4-D)+500 mg/L(MES)+200 μmol/L(AS).

基本培養(yǎng)基：MS+0.7%瓊脂,pH 5.8.

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+1 mg/L(2,4-D)+500 mg/L(MES)+200 μmol/L(AS),pH 5.8.

濾菌培養(yǎng)基：MS+0.1 mg/L(NAA)+3 mg/L(6-BA)+5 mg/L(AgNO3)+400 mg/L(Car),pH 5.8.

分化篩選培養(yǎng)基：MS+0.1 mg/L(NAA)+3 mg/L(6-BA)+5 mg/L(AgNO3)+400 mg/L(Car)+Kan ,pH 5.8.

生根培養(yǎng)基：MS+0.2 mg/L(NAA)+400 mg/L(Car)+Kan, pH 6.0.

所有培養(yǎng)基如沒有特殊說明，均為121 ℃條件下，高溫高壓滅菌20 min，現(xiàn)用現(xiàn)配.

瓊脂、蛋白胨、酵母提取物和抗生素均為Solarbio分裝,其他生化試劑和常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進口分析純.

1.2 方法

1.2.1無菌苗的獲得

(1) 首先進行種子消毒，選取籽粒飽滿、大小均一的油菜種子放于三角瓶內(nèi)，用0.1% HgCl2消毒7 min，無菌水清洗4次，用滅過菌的吸水紙將水分吸干；

(2) 將滅好菌的種子均勻擺放在基本培養(yǎng)基上，封好瓶口，置于28 ℃和16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)，待萌發(fā)后取其生長5 d的子葉柄做為實驗材料.

1.2.2農(nóng)桿菌培養(yǎng)

(1) 挑取攜帶植物表達載體質(zhì)粒PBI121-SHN1/WIN1的農(nóng)桿菌單菌落，接種在10 ml含40 mg/L Str和100 mg/L Kan的YEB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃和200 rpm環(huán)境中振蕩培養(yǎng)過夜.

(2)活化過夜的農(nóng)桿菌按1∶100(V∶V)的比例接種在相同的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)直到OD600為0.4.

(3)用12 000 rpm離心5 min，收集菌體，用重懸培養(yǎng)基同體積重懸使用.

1.2.3外植體的侵染及共培養(yǎng)

在超凈工作臺中打開瓶蓋，用解剖刀將苗切下放到滅過菌的培養(yǎng)皿中，加入少量無菌水，防止時間過長幼苗失水影響再生活性.再用解剖刀將下胚軸和子葉柄切下，下胚軸長度約0.5～1 cm，子葉柄切口應(yīng)盡量靠近生長點，且要除去生長點.切完后移入另一培養(yǎng)皿中，用重懸好的菌液侵染5 min.

(1)共培養(yǎng)：吸水紙吸干表面菌液,隨后將子葉柄均勻擺放在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3 d.

(2)濾菌培養(yǎng)：將共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到濾菌培養(yǎng)基上，在28 ℃和16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)3～7 d.

(3)分化篩選培養(yǎng)：將外植體濾菌培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上，在28 ℃和16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)21 d左右，外植體表面開始出現(xiàn)白色愈傷組織，之后長出大量綠色小芽或者白化苗.

(4)繼代培養(yǎng)：將長出大量愈傷組織的抗性外植體分割成小塊后轉(zhuǎn)入分化篩選培養(yǎng)基，此時的篩選壓力為14 mg/L.

(5)生根培養(yǎng)：待篩選的抗性芽長至3～5 cm時，切下并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，獲得具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因油菜植株.7～10 d后傷口處有根長出，40 d左右形成根系，經(jīng)一周煉苗，即可進行移栽.

1.2.4培養(yǎng)條件對轉(zhuǎn)化的影響

所有組織培養(yǎng)過程，若無特別說明，都是在28 ℃、16 h光照/8 h黑暗光周期、光照強度為1 600～ 2 000 Lx的光照培養(yǎng)室中進行.農(nóng)桿菌平板的培養(yǎng)是在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，預(yù)活化及其活化均在28 ℃、200 rpm的恒溫搖床上進行.

2 結(jié)果和分析

2.1 卡那霉素濃度對帶柄子葉分化的影響

植物表達載體PBI121-SHN1/WIN1帶有NptII抗Kan基因，為了確定外植體對卡那霉素的臨界值，將未侵染菌液的預(yù)培養(yǎng)帶柄子葉置入不同濃度卡那霉素的分化培養(yǎng)基，每個梯度3個重復(fù)，進行敏感度實驗，其結(jié)果見表1.由表1可知，帶柄子葉對卡那霉素較為敏感，當(dāng)卡那霉素濃度為9 mg/L時，比未加Kan的對照(CK)減少了將近53.34%；當(dāng)卡那霉素濃度為11 mg/L時，芽的誘導(dǎo)率明顯下降，且分化苗幾乎為白化苗，因此將卡那霉素篩選濃度初步定為11 mg/L.由此說明，隨著Kan濃度的提高，其選擇壓力增強，即Kan濃度越高，逃脫選擇的綠芽減少且對芽的再生有強烈的抑制作用.

2.2 菌液濃度與侵染時間對轉(zhuǎn)化的影響

在油菜農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化中，適宜的農(nóng)桿菌感染濃度和侵染時間是影響遺傳轉(zhuǎn)化成功與否的重要因素.表2和表3表明，當(dāng)OD600值為0.4時，侵染5 min卡那霉素分化苗最高，隨著菌液濃度的升高(OD600>0.4)，侵染時間越長，外植體被侵染越厲害，致使外植體切口部位變黑、腐爛，甚至大量褐化死亡.研究表明，農(nóng)桿菌對外植體的侵染時間過短，菌液濃度偏低，導(dǎo)致受體細胞未被侵染，使假陽性再生芽增多.

表1 外植體對卡那霉素的敏感度實驗Tab.1 Sensitivity of explants to kannmycin

注：/表示無，+表示少

表2 菌液濃度對轉(zhuǎn)化的影響Tab.2 Effects of bacterium concentration on transformation

注：/表示無，+表示少,++表示一般,+++表示多;后面表格同樣表示

2.3 共培養(yǎng)時間對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

根癌農(nóng)桿菌的粘附、T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合過程都在共培養(yǎng)時期，共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的一個重要環(huán)節(jié)，掌握好合適的共培養(yǎng)時間和方法非常重要.由表4可以看出，外植體共培養(yǎng)24 h后，開始有抗性芽的出現(xiàn)，不過頻率很低；當(dāng)共培養(yǎng)48 h時，外植體的轉(zhuǎn)化率已明顯提高；但是共培養(yǎng)時間超過72 h后，不定芽的分化頻率不斷下降，農(nóng)桿菌泛濫嚴重，褐化死亡的外植體也急劇增加；到共培養(yǎng)96 h后，外植體幾乎全部死亡.上述結(jié)果表明，共培養(yǎng)時間為48 h時，轉(zhuǎn)化率最高，可定為本實驗所用油菜品種的最適共培養(yǎng)時間.

表3 菌液侵染時間對轉(zhuǎn)化的影響Tab.3 Effects of bacterium immerged time on transformation

表4 共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化效果的影晌Tab.4 Effect of cocultivation time on transformation frequency

2.4 乙酰丁香酮(AS)對轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化作為一種天然的植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，宿主植物細胞能分泌某些酚類化合物，可誘發(fā)農(nóng)桿菌內(nèi)Ti或Ri質(zhì)粒DNA上Vir區(qū)的活化和高效表達，促進農(nóng)桿菌T-DNA向宿主細胞核轉(zhuǎn)移，從而提高遺傳轉(zhuǎn)化效率.其中常用且誘導(dǎo)效果最佳的是乙酰丁香酮(AS)，AS作為誘導(dǎo)性最好的酚類化合物，被廣泛應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化中，取得了較好的效果，使得農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法更加完善.原理是誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因的活化，從而促進外源基因的整合.所以最好讓其有一定的誘導(dǎo)時間再轉(zhuǎn)化，而不是加完后直接轉(zhuǎn)化(活化需要一段時間)，就是在重懸培養(yǎng)基中和共培養(yǎng)基中都加入AS，濃度為200 μmol/L，效果會更好.說明AS可提高油菜的再生頻率及轉(zhuǎn)化率，這與藍海燕[9]等人的研究結(jié)果一致.

2.5 AgNO3對轉(zhuǎn)化的影響

在封閉的培養(yǎng)容器中，植物細胞在離體培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生乙烯，造成乙烯的過量積累，從而影響外植體的生長和分化芽的產(chǎn)生.加入AgNO3，一方面可以抑制乙烯的活性，促進植物器官和體細胞胚胎的發(fā)生；另一方面，還具有降低玻璃苗的產(chǎn)生概率和抑制外植體褐化等功能，從而提高油菜的再生率和遺傳轉(zhuǎn)化率.本試驗發(fā)現(xiàn)，添加一定量的AgNO3(濃度為5～10 mg/L)，可促進芽的再生，大大降低外植體褐化的現(xiàn)象[10]，也不會對外植體產(chǎn)生負作用.

3 結(jié)論與討論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)是油菜轉(zhuǎn)化最常用的一種方法.在轉(zhuǎn)化過程中，許多因素都對轉(zhuǎn)化效果有一定的影響，包括植物的基因型、所采用的外植體及其狀態(tài)、培養(yǎng)條件和選擇方法等.本研究可得出如下結(jié)論：

(1)使用5 d苗齡的帶柄子葉作為轉(zhuǎn)化受體，具有再生率高、再生周期短以及對農(nóng)桿菌敏感等特點，這一實驗結(jié)果與梁會娟[11]等人研究相符.

(2)卡那霉素的篩選濃度非常重要，確定11 mg/L為該實驗篩選的臨界濃度.只有確定卡那霉素的臨界值，才能降低再生苗的假陽性率，減少后續(xù)抗性苗篩選的工作量，方便篩選工作的順利進行.因此在整個的篩選轉(zhuǎn)化體系中，前期篩選應(yīng)采用較低濃度的抗生素，待芽長出后再用高濃度的抗生素篩選，這樣可以避免剔除轉(zhuǎn)基因綠苗，從而大大提高轉(zhuǎn)化效率[12-13].

(3)侵染時間為5 min時，其外植體轉(zhuǎn)化率最高.通過菌液濃度與侵染時間對外植體的實驗，表明菌液濃度OD600值為0.4時，轉(zhuǎn)化率最高，這與何業(yè)華[14]等人研究結(jié)果相似，褐化程度較弱.

(4)共培養(yǎng)時間的長短在很大程度上影響著轉(zhuǎn)化率.試驗表明，共培養(yǎng)時間為48 h時效果最好，不僅有利于外源基因的整合，也不會造成農(nóng)桿菌的過度增殖.

(5)在培養(yǎng)基中添加AgNO3，不僅可以防止褐化，而且能夠提高轉(zhuǎn)化率；在重懸培養(yǎng)基和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加AS可明顯提高轉(zhuǎn)化效率.

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