劉 品, 趙萬千, 史團省, 沙琰琰, 張志杰, 朱 墨

(鄭州大學 生物工程系 生物多樣性與生態(tài)學研究所 河南 鄭州 450001)

0 引言

通過基因工程手段改良油菜的產(chǎn)量、品質及抗逆性，建立良好的油菜轉化體系至關重要.油菜的遺傳轉化始于20世紀80年代后期，利用轉基因技術已經(jīng)培育出抗病[1]、抗蟲、抗除草劑及品質改良[2]的轉基因材料.

2004年文獻[3]第一次克隆了WIN1基因,目的是通過基因工程技術將SHN1/WIN1基因插入甘藍型油菜中油821，使其角質膜厚度和成分有所改變，主要是防止自身體內水分過度蒸騰散失，保持體內水分的平衡[4-5],以此來提高油菜的抗旱、抗寒和抗病等性能，為提高油菜抗逆性，特別是為抗旱和抗寒性育種奠定基礎.該項研究不僅對認識和揭示植物角質膜的結構功能具有重要理論意義，而且對應用植物基因工程技術改良和培育抗逆性強的作物優(yōu)良品種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)都具有重要的應用價值[6-7].

本研究以甘藍型油菜中油821為實驗材料，對影響農(nóng)桿菌介導法轉化效率的主要因素進行了探討，采用根癌農(nóng)桿菌方法將控制角質膜厚度和成分的SHN1/WIN1基因轉化到甘藍型油菜中，目的是防止油菜自身體內水分過度蒸騰散失，保持體內水分的平衡,提高油菜抗旱、抗寒和抗病能力，提高油菜抗逆性.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1植物材料 試驗材料為甘藍型油菜中油821，種子由中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所饋贈.播種出苗后，取苗齡為4～5 d的無菌葉柄作為轉化外植體.

1.1.2菌株和質粒 植物表達載體PBI121-SHN1/WIN1和根癌農(nóng)桿菌均由鄭州大學生物工程系植物生理與營養(yǎng)實驗室構建和保存.植物表達載體PBI121-SHN1/WIN1帶有NptII抗Kan基因[8].

1.1.3培養(yǎng)基 試驗所用培養(yǎng)基主要有以下幾種：

YEB培養(yǎng)基：牛肉膏(5 g/L),酵母抽提物(1 g/L),蛋白胨(5 g/L),蔗糖(5 g/L),MgSO4(2 mmol/L)，pH 7.2，固體培養(yǎng)基含瓊脂15 g/L.

重懸培養(yǎng)基：1/2(MS)+1 mg/L(2,4-D)+500 mg/L(MES)+200 μmol/L(AS).

基本培養(yǎng)基：MS+0.7%瓊脂,pH 5.8.

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+1 mg/L(2,4-D)+500 mg/L(MES)+200 μmol/L(AS),pH 5.8.

濾菌培養(yǎng)基：MS+0.1 mg/L(NAA)+3 mg/L(6-BA)+5 mg/L(AgNO3)+400 mg/L(Car),pH 5.8.

分化篩選培養(yǎng)基：MS+0.1 mg/L(NAA)+3 mg/L(6-BA)+5 mg/L(AgNO3)+400 mg/L(Car)+Kan ,pH 5.8.

生根培養(yǎng)基：MS+0.2 mg/L(NAA)+400 mg/L(Car)+Kan, pH 6.0.

所有培養(yǎng)基如沒有特殊說明，均為121 ℃條件下，高溫高壓滅菌20 min，現(xiàn)用現(xiàn)配.

瓊脂、蛋白胨、酵母提取物和抗生素均為Solarbio分裝,其他生化試劑和常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進口分析純.

1.2 方法

1.2.1無菌苗的獲得

(1) 首先進行種子消毒，選取籽粒飽滿、大小均一的油菜種子放于三角瓶內，用0.1% HgCl2消毒7 min，無菌水清洗4次，用滅過菌的吸水紙將水分吸干；

(2) 將滅好菌的種子均勻擺放在基本培養(yǎng)基上，封好瓶口，置于28 ℃和16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)，待萌發(fā)后取其生長5 d的子葉柄做為實驗材料.

1.2.2農(nóng)桿菌培養(yǎng)

(1) 挑取攜帶植物表達載體質粒PBI121-SHN1/WIN1的農(nóng)桿菌單菌落，接種在10 ml含40 mg/L Str和100 mg/L Kan的YEB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃和200 rpm環(huán)境中振蕩培養(yǎng)過夜.

(2)活化過夜的農(nóng)桿菌按1∶100(V∶V)的比例接種在相同的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)直到OD600為0.4.

(3)用12 000 rpm離心5 min，收集菌體，用重懸培養(yǎng)基同體積重懸使用.

1.2.3外植體的侵染及共培養(yǎng)

在超凈工作臺中打開瓶蓋，用解剖刀將苗切下放到滅過菌的培養(yǎng)皿中，加入少量無菌水，防止時間過長幼苗失水影響再生活性.再用解剖刀將下胚軸和子葉柄切下，下胚軸長度約0.5～1 cm，子葉柄切口應盡量靠近生長點，且要除去生長點.切完后移入另一培養(yǎng)皿中，用重懸好的菌液侵染5 min.

(1)共培養(yǎng)：吸水紙吸干表面菌液,隨后將子葉柄均勻擺放在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3 d.

(2)濾菌培養(yǎng)：將共培養(yǎng)的外植體轉移到濾菌培養(yǎng)基上，在28 ℃和16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)3～7 d.

(3)分化篩選培養(yǎng)：將外植體濾菌培養(yǎng)基轉移到篩選培養(yǎng)基上，在28 ℃和16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)21 d左右，外植體表面開始出現(xiàn)白色愈傷組織，之后長出大量綠色小芽或者白化苗.

(4)繼代培養(yǎng)：將長出大量愈傷組織的抗性外植體分割成小塊后轉入分化篩選培養(yǎng)基，此時的篩選壓力為14 mg/L.

(5)生根培養(yǎng)：待篩選的抗性芽長至3～5 cm時，切下并轉入生根培養(yǎng)基誘導生根，獲得具有卡那霉素抗性的轉基因油菜植株.7～10 d后傷口處有根長出，40 d左右形成根系，經(jīng)一周煉苗，即可進行移栽.

1.2.4培養(yǎng)條件對轉化的影響

所有組織培養(yǎng)過程，若無特別說明，都是在28 ℃、16 h光照/8 h黑暗光周期、光照強度為1 600～ 2 000 Lx的光照培養(yǎng)室中進行.農(nóng)桿菌平板的培養(yǎng)是在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，預活化及其活化均在28 ℃、200 rpm的恒溫搖床上進行.

2 結果和分析

2.1 卡那霉素濃度對帶柄子葉分化的影響

植物表達載體PBI121-SHN1/WIN1帶有NptII抗Kan基因，為了確定外植體對卡那霉素的臨界值，將未侵染菌液的預培養(yǎng)帶柄子葉置入不同濃度卡那霉素的分化培養(yǎng)基，每個梯度3個重復，進行敏感度實驗，其結果見表1.由表1可知，帶柄子葉對卡那霉素較為敏感，當卡那霉素濃度為9 mg/L時，比未加Kan的對照(CK)減少了將近53.34%；當卡那霉素濃度為11 mg/L時，芽的誘導率明顯下降，且分化苗幾乎為白化苗，因此將卡那霉素篩選濃度初步定為11 mg/L.由此說明，隨著Kan濃度的提高，其選擇壓力增強，即Kan濃度越高，逃脫選擇的綠芽減少且對芽的再生有強烈的抑制作用.

2.2 菌液濃度與侵染時間對轉化的影響

在油菜農(nóng)桿菌介導法轉化中，適宜的農(nóng)桿菌感染濃度和侵染時間是影響遺傳轉化成功與否的重要因素.表2和表3表明，當OD600值為0.4時，侵染5 min卡那霉素分化苗最高，隨著菌液濃度的升高(OD600>0.4)，侵染時間越長，外植體被侵染越厲害，致使外植體切口部位變黑、腐爛，甚至大量褐化死亡.研究表明，農(nóng)桿菌對外植體的侵染時間過短，菌液濃度偏低，導致受體細胞未被侵染，使假陽性再生芽增多.

表1 外植體對卡那霉素的敏感度實驗Tab.1 Sensitivity of explants to kannmycin

注：/表示無，+表示少

表2 菌液濃度對轉化的影響Tab.2 Effects of bacterium concentration on transformation

注：/表示無，+表示少,++表示一般,+++表示多;后面表格同樣表示

2.3 共培養(yǎng)時間對遺傳轉化的影響

根癌農(nóng)桿菌的粘附、T-DNA的轉移和整合過程都在共培養(yǎng)時期，共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌介導遺傳轉化的一個重要環(huán)節(jié)，掌握好合適的共培養(yǎng)時間和方法非常重要.由表4可以看出，外植體共培養(yǎng)24 h后，開始有抗性芽的出現(xiàn)，不過頻率很低；當共培養(yǎng)48 h時，外植體的轉化率已明顯提高；但是共培養(yǎng)時間超過72 h后，不定芽的分化頻率不斷下降，農(nóng)桿菌泛濫嚴重，褐化死亡的外植體也急劇增加；到共培養(yǎng)96 h后，外植體幾乎全部死亡.上述結果表明，共培養(yǎng)時間為48 h時，轉化率最高，可定為本實驗所用油菜品種的最適共培養(yǎng)時間.

表3 菌液侵染時間對轉化的影響Tab.3 Effects of bacterium immerged time on transformation

表4 共培養(yǎng)時間對轉化效果的影晌Tab.4 Effect of cocultivation time on transformation frequency

2.4 乙酰丁香酮(AS)對轉化的影響

農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化作為一種天然的植物基因轉化系統(tǒng)，宿主植物細胞能分泌某些酚類化合物，可誘發(fā)農(nóng)桿菌內Ti或Ri質粒DNA上Vir區(qū)的活化和高效表達，促進農(nóng)桿菌T-DNA向宿主細胞核轉移，從而提高遺傳轉化效率.其中常用且誘導效果最佳的是乙酰丁香酮(AS)，AS作為誘導性最好的酚類化合物，被廣泛應用于植物遺傳轉化中，取得了較好的效果，使得農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法更加完善.原理是誘導農(nóng)桿菌Vir基因的活化，從而促進外源基因的整合.所以最好讓其有一定的誘導時間再轉化，而不是加完后直接轉化(活化需要一段時間)，就是在重懸培養(yǎng)基中和共培養(yǎng)基中都加入AS，濃度為200 μmol/L，效果會更好.說明AS可提高油菜的再生頻率及轉化率，這與藍海燕[9]等人的研究結果一致.

2.5 AgNO3對轉化的影響

在封閉的培養(yǎng)容器中，植物細胞在離體培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生乙烯，造成乙烯的過量積累，從而影響外植體的生長和分化芽的產(chǎn)生.加入AgNO3，一方面可以抑制乙烯的活性，促進植物器官和體細胞胚胎的發(fā)生；另一方面，還具有降低玻璃苗的產(chǎn)生概率和抑制外植體褐化等功能，從而提高油菜的再生率和遺傳轉化率.本試驗發(fā)現(xiàn)，添加一定量的AgNO3(濃度為5～10 mg/L)，可促進芽的再生，大大降低外植體褐化的現(xiàn)象[10]，也不會對外植體產(chǎn)生負作用.

3 結論與討論

農(nóng)桿菌介導是油菜轉化最常用的一種方法.在轉化過程中，許多因素都對轉化效果有一定的影響，包括植物的基因型、所采用的外植體及其狀態(tài)、培養(yǎng)條件和選擇方法等.本研究可得出如下結論：

(1)使用5 d苗齡的帶柄子葉作為轉化受體，具有再生率高、再生周期短以及對農(nóng)桿菌敏感等特點，這一實驗結果與梁會娟[11]等人研究相符.

(2)卡那霉素的篩選濃度非常重要，確定11 mg/L為該實驗篩選的臨界濃度.只有確定卡那霉素的臨界值，才能降低再生苗的假陽性率，減少后續(xù)抗性苗篩選的工作量，方便篩選工作的順利進行.因此在整個的篩選轉化體系中，前期篩選應采用較低濃度的抗生素，待芽長出后再用高濃度的抗生素篩選，這樣可以避免剔除轉基因綠苗，從而大大提高轉化效率[12-13].

(3)侵染時間為5 min時，其外植體轉化率最高.通過菌液濃度與侵染時間對外植體的實驗，表明菌液濃度OD600值為0.4時，轉化率最高，這與何業(yè)華[14]等人研究結果相似，褐化程度較弱.

(4)共培養(yǎng)時間的長短在很大程度上影響著轉化率.試驗表明，共培養(yǎng)時間為48 h時效果最好，不僅有利于外源基因的整合，也不會造成農(nóng)桿菌的過度增殖.

(5)在培養(yǎng)基中添加AgNO3，不僅可以防止褐化，而且能夠提高轉化率；在重懸培養(yǎng)基和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加AS可明顯提高轉化效率.

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