員麗娟，史 茜，季新成，牛國(guó)輝

（1.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，烏魯木齊，830063；2. 新疆計(jì)量測(cè)試研究院，烏魯木齊，830011）

新孢子蟲?。∟eosporosis）是由犬新孢子蟲（Neospora caninum）寄生在宿主體內(nèi)的一種原蟲病，垂直傳播是該病最主要的傳播途徑，是造成奶牛流產(chǎn)、產(chǎn)弱胎、死胎、木乃伊胎的主要原因之一，給畜牧業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。我國(guó)也有該病發(fā)生的報(bào)道[3]。迄今為止，還沒(méi)有防治新孢子蟲病的有效藥物和疫苗，準(zhǔn)確快速的檢測(cè)方法對(duì)于該病的防控至關(guān)重要。

熒光PCR方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，國(guó)外已有很多應(yīng)用該方法對(duì)新孢子蟲病進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道[4-5]，國(guó)內(nèi)尚無(wú)該方面的研究。本研究建立了檢測(cè)新孢子蟲病的熒光PCR方法，為該病的精確、快速檢測(cè)提供了新的技術(shù)手段。

1 材料

1.1 陽(yáng)性核酸和臨床樣品 新孢子蟲陽(yáng)性核酸和剛地弓形蟲陽(yáng)性核酸由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)劉群教授惠贈(zèng)；含有牛新孢子蟲NC-5基因的陽(yáng)性核酸由新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；牛傳染性牛鼻氣管炎、牛環(huán)形泰勒蟲、牛瑟氏泰勒蟲和牛伊氏錐蟲等病原陽(yáng)性核酸樣品由新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室保存；?？鼓土鳟a(chǎn)胎兒組織病料等樣品采自新疆不同牛場(chǎng)。

1.2 主要試劑及儀器 全血基因組DNA提取試劑盒（DP1102）、DNAzol基因組DNA快速提取試劑（DP3002）為百泰克公司產(chǎn)品；pMD18-T載體（D101A）、凝膠純化回收試劑盒、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、DL 2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；引物、探針均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

ABI7300熒光PCR儀為ABI公司產(chǎn)品；常規(guī)PCR儀為Biometra公司產(chǎn)品；Lambda35紫外分光光度計(jì)為PE公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 引物和探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)N.Caninum的Nc-5基因序列（登錄號(hào)：X84238.1）設(shè)計(jì)擴(kuò)增出138 bp的特異性引物2條（Np和Nr）和探針1條（NTpro），序列分別為：Np：5'-GTG GTT TGT GGT TAG TCA TTC G-3'，Nr：5'-GCA TAA TCT CCC CCG TCA TCA G-3'，NTpro：5'-FAM- CAC GTT GAA ATC AGC CTG CGT CAGECLIPSE -3'。

2.2 模板DNA的制備 抗凝全血按照全血基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作；流產(chǎn)胎兒組織先經(jīng)液氮研磨，然后按照百泰克公司的DNAzol基因組提取試劑說(shuō)明進(jìn)行操作。

2.3 熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件的優(yōu)化 以已知陽(yáng)性核酸為模板，以Np、Nr、NTpro為引物和探針進(jìn)行擴(kuò)增，Mg2+濃度分別為1.0～4.0mmol/L，dNTP濃度分別為0.1～0.4mmol/L，引物濃度分別為0.2～0.8mmol/L，探針濃度分別為0.1～0.4mmol/L，Taq DNA 聚合酶分別為0.75～1.5 u，Tm為59～61 ℃，循環(huán)參數(shù)分別為40、45和50，優(yōu)化一項(xiàng)時(shí)其他參數(shù)不變。

2.4 特異性檢測(cè) 用優(yōu)化后的熒光PCR方法分別對(duì)牛傳染性牛鼻氣管炎病毒、剛地弓形蟲、牛環(huán)形泰勒蟲、牛雙芽巴貝斯蟲、牛瑟氏泰勒蟲和牛伊氏錐蟲等核酸進(jìn)行擴(kuò)增。每次擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)設(shè)雙蒸水作陰性對(duì)照和牛新孢子蟲作陽(yáng)性對(duì)照，以驗(yàn)證方法特異性。

2.5 靈敏性檢測(cè) 以109～100拷貝/反應(yīng)系列梯度的重組質(zhì)粒為模板，用本研究建立的熒光PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。熒光PCR以出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，Ct<40，且陰性對(duì)照和空白對(duì)照均沒(méi)有S型擴(kuò)增曲線和Ct值，作為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，以結(jié)果為陽(yáng)性的最高稀釋度作為檢測(cè)靈敏度。

2.6 重復(fù)性檢測(cè) 對(duì)107、105和103拷貝/反應(yīng)的重組質(zhì)粒進(jìn)行3次重復(fù)性擴(kuò)增，以驗(yàn)證方法的重復(fù)性。

2.8 臨床樣品的檢測(cè) 對(duì)采自牛新孢子蟲病流行區(qū)的50份全血和8份流產(chǎn)胎兒腦組織用本研究建立的熒光PCR方法和二溫式PCR方法進(jìn)行檢測(cè)[6]。

3 結(jié)果

3.1 熒光PCR反應(yīng)條件建立 25 μL反應(yīng)體系，其中Mg2+1.5mmol/L，dNTP 各0.2mmol/L，引物各0.4mmol/L，探針0.2mmol/L，Taq酶1.25 u，模板 1 μL，擴(kuò)增條件為50 ℃，2 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃，5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，57 ℃ 45 s，45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增曲線見圖1。

3.2 方法的特異性檢測(cè) 通過(guò)對(duì)剛地弓形蟲、牛傳染性牛鼻氣管炎病毒、牛環(huán)形泰勒蟲、牛瑟氏泰勒蟲和牛伊氏錐蟲等核酸樣品進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明該方法具有良好的特異性。

3.3 方法的靈敏度檢測(cè) 經(jīng)對(duì)109～100拷貝/反應(yīng)系列梯度的重組質(zhì)粒進(jìn)行熒光PCR 擴(kuò)增，可檢測(cè)到101拷貝/反應(yīng)的重組質(zhì)粒（圖2）。并繪制擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線 （圖3）。在所測(cè)的濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與對(duì)應(yīng)的Ct值呈現(xiàn)明顯的線性相關(guān)關(guān)系，其回歸曲線的斜率為-3.083，截距為42.052，相關(guān)系數(shù)R2為0.997。

3.4 方法的重復(fù)性檢測(cè) 分別對(duì)107、105和103拷貝/反應(yīng)的重組質(zhì)粒進(jìn)行3次重復(fù)性擴(kuò)增檢測(cè)，不同試驗(yàn)獲得的Ct值變異系數(shù)為0.50%～1.18%，表明該方法具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性（圖4）。

3.5 對(duì)臨床樣品的檢測(cè) 對(duì)采自牛新孢子蟲病流行區(qū)的50份全血和8 份流產(chǎn)胎兒腦組織進(jìn)行檢測(cè)，本研究建立的熒光PCR方法的陽(yáng)性檢出率均為10.3%（其中全血5份，流產(chǎn)胎兒1份），二溫式PCR方法的陽(yáng)性檢出率為7%（其中全血3份，流產(chǎn)胎兒1份），表明該熒光PCR具有較高的檢測(cè)靈敏度。

4 討論

PCR方法具有快速、準(zhǔn)確且操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是目前對(duì)新孢子蟲病進(jìn)行快速檢測(cè)的常用方法[7-8]。熒光PCR是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新的檢測(cè)技術(shù)，與普通PCR方法相比較，不需電泳，可有效減少污染的發(fā)生，并能進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度和特異性[4-5]。目前，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)該病的報(bào)道。

Nc-5基因是新孢子蟲基因組中最為保守的基因，且該基因僅存在于犬新孢子蟲基因組中[9]。本研究以該基因?yàn)檠芯繉?duì)象，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，進(jìn)一步增加了方法的特異性。該方法能夠檢測(cè)10個(gè)拷貝/反應(yīng)的核酸分子，與普通PCR相比較，進(jìn)一步增加了檢測(cè)結(jié)果的靈敏度，該方法具有較好的可重復(fù)性，通過(guò)對(duì)臨床樣品的檢測(cè)，具有較好的應(yīng)用效果。

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