吳 娟，秦曉冰，單 虎

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

近年來(lái)，隨著集約化養(yǎng)殖，由水貂綠膿桿菌（銅綠假單胞菌）（Pseudomonas aeruginosa，PA）導(dǎo)致的水貂出血性肺炎常表現(xiàn)為群體性急性暴發(fā)，水貂前期咳嗽，后期體溫升高，呼吸困難，口鼻流血，死亡率逐年增高。綠膿桿菌對(duì)外界的抵抗力極強(qiáng)，由于臨床治療中抗菌藥物的廣泛使用，不合理應(yīng)用，甚至濫用及畜牧業(yè)中飼料不恰當(dāng)添加等，導(dǎo)致綠膿桿菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，耐藥譜不斷擴(kuò)大，形成惡性循環(huán)，同時(shí)也加劇了抗菌藥物在水貂體內(nèi)的殘留，嚴(yán)重威脅我國(guó)皮毛業(yè)的發(fā)展，并對(duì)人類(lèi)的身體健康帶來(lái)了潛在危害。我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)中的綠膿桿菌耐藥情況已是十分嚴(yán)重，且呈現(xiàn)多重耐藥特性[1-2]。因此獲得一種理想的疫苗來(lái)預(yù)防水貂綠膿桿菌病顯得尤為重要。

細(xì)菌鞭毛（f l agella）是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官并與細(xì)菌的生存密切相關(guān)[3]，鞭毛具有不耐熱性抗原，在細(xì)菌致病過(guò)程中，鞭毛也直接參與細(xì)菌與宿主的粘附、感染與致病等過(guò)程，是細(xì)菌最重要的致病因子，而鞭毛蛋白是其主要的組成元件[4-5]。

綠膿桿菌的致病性與其產(chǎn)生多種毒力因子息息相關(guān)，毒素是綠膿桿菌致病的物質(zhì)基礎(chǔ)。綠膿桿菌主要有3類(lèi)毒素，即粘附因子、內(nèi)毒素（LPS）、胞外產(chǎn)物。細(xì)菌粘附于宿主細(xì)胞表面是對(duì)機(jī)體感染致病的先決條件，對(duì)細(xì)菌侵入宿主并有效發(fā)揮毒素等的作用具有重要意義[6]。鞭毛就是一種重要的粘附因子，毒力實(shí)驗(yàn)表明綠膿桿菌鞭毛是動(dòng)物感染過(guò)程中的一個(gè)毒力細(xì)胞器.鞭毛不僅與運(yùn)動(dòng)有關(guān)，更重要的是在感染與免疫以及分類(lèi)鑒定等方面發(fā)揮重要的作用，特別是免疫原性具有重要的實(shí)際意義。Yancey將粗制鞭毛于100℃加熱15 min，破壞其蛋白成分后再免疫動(dòng)物，結(jié)果其保護(hù)力喪失，這提示鞭毛中的保護(hù)性抗原是鞭毛蛋白[7]。綠膿桿菌鞭毛蛋白不僅可以激發(fā)機(jī)體的體液免疫，還可以引起細(xì)胞免疫，具備作為優(yōu)良亞單位疫苗的主要特點(diǎn)。

綠膿桿菌屬于革蘭氏陰性菌， 綠膿桿菌鞭毛為極端鞭毛呈單個(gè)或成對(duì)排列，由蛋白質(zhì)構(gòu)成，是重要的表面抗原，不同血清型間有相同的鞭毛蛋白免疫原，產(chǎn)生免疫保護(hù)作用[8]，為疾病的診斷提供了特異性抗原，水貂SD03PA株血清型為F型，鞭毛呈b型，大部分水貂均感染此類(lèi)型菌株而發(fā)病。

菌鞭毛蛋白的分離已有報(bào)道，包括細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，收集細(xì)菌用不同方法使其從菌體脫落，然后純化。但分離過(guò)程中可能由于培養(yǎng)基帶來(lái)其他蛋白，裂菌時(shí)菌體破裂釋放蛋白，甚至造成需要提取的鞭毛蛋白部分變性。為提高所培養(yǎng)細(xì)菌的產(chǎn)量，同時(shí)保持其穩(wěn)定的理化特性，我們對(duì)提取方法做了簡(jiǎn)單改良：采用不同的酸堿度使鞭毛蛋白從菌體脫落，并結(jié)合機(jī)械振蕩法，用（NH4）2SO4鹽析獲得鞭毛蛋白。結(jié)果更易得到產(chǎn)量高、純度高的樣品，節(jié)約了成本和時(shí)間，也為下一步鑒定提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.2 菌株 水貂綠膿桿菌（PASD03株）（由實(shí)驗(yàn)室從患病水貂臟器中分離純化，鑒定并保存所提供），由標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 27853 （山東省農(nóng)科院提供）質(zhì)控所得。

1.1.3 主要儀器 臺(tái)式超高速冷凍離心機(jī)SIGMA3K30（北京博勱行儀器有限公司）；渦旋振蕩器（上海滬西儀器廠）；DELTA320電子pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)）；微型垂直板電泳槽（北京市六一儀器廠）；CL-1A磁力攪拌器（上海一科儀器設(shè)備有限公司）；JEM-1200 EX型透射電鏡（日本JEOL公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 將肉湯培養(yǎng)液中培養(yǎng)好的綠膿桿菌接種到瓊脂表面（大培養(yǎng)皿每個(gè)加1 mL，小培養(yǎng)皿加30 μL），37 ℃培養(yǎng)17～30 h后，用玻璃棒刮取菌苔，適量生理鹽水重懸。

1.2.1.2 將培養(yǎng)好的菌株接種到500 mL肉湯中，放入恒溫?fù)u床中，轉(zhuǎn)速120 r/min，37 ℃孵育12～16 h。

1.2.2 酸解法提取綠膿桿菌鞭毛蛋白

將1.2.1培養(yǎng)好的菌株4 ℃ 6000 r/min離心30 min收集細(xì)菌，PBS洗三次，加入1 mol/L鹽酸調(diào)至pH2.0，室溫磁力攪拌30 min裂解細(xì)菌，4 ℃ 10000 r/min離心1 h后，去除菌體，取上清4 ℃ 20000 r/min離心1 h，去雜質(zhì)，上清液用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH7.2，冰浴30 min，將上清置磁力攪拌器上緩緩加入飽和硫酸銨溶液，至飽和度67%，4 ℃過(guò)夜15000 r/min離心30 min，沉淀用生理鹽水透析48 h后，少量分裝-20 ℃凍存。

1.2.3 差速離心法提取綠膿桿菌鞭毛蛋白

將1.2.1中培養(yǎng)好的菌株4 ℃離心5000r/min離心30 min。PBS洗三次，菌團(tuán)懸浮于PBS中，置攪拌器內(nèi)攪拌30 min以裂解細(xì)菌，再于4 ℃以16000 r/min離心15 min。取上清以40000r/min離心3h，取沉淀，混懸于少量PBS中，生理鹽水透析48 h，少量分裝-20 ℃凍存。

1.2.4 酸解法結(jié)合機(jī)械振蕩提取綠膿桿菌鞭毛蛋白

將1.2.2中用1 mol/L鹽酸調(diào)至pH2.0后所得到的菌液，加入等量無(wú)菌玻璃渣于旋渦振蕩器上劇裂震蕩30 min，4 ℃以10000 r/min離心1 h，去除菌體和雜質(zhì)，取上清液于4 ℃以40000 r/min離心1 h，上清用1 mol/LNaOH溶液調(diào)pH7.2，冰浴30 min，將上清置磁力攪拌器上緩緩加入飽和硫酸銨溶液，至飽和度67%，4 ℃過(guò)夜，15000 r/min離心30 min，沉淀用生理鹽水透析48 h后，SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)以及電鏡觀察并少量分裝-20℃凍存。

1.2.5 SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)分析鞭毛蛋白

1.2.5.1 組裝模具 將已清洗干凈的兩塊玻璃板用封條封嚴(yán)，組裝在電泳架上，然后固定結(jié)實(shí)。

1.2.5.2 制膠[9-10]

配制10 mL 12%分離膠：水3.3 mL，30%丙烯酰胺—雙丙烯酰胺4.0 mL，1.5 mol/L Tris（pH8.8） 2.5 mL，10%（W/V）SDS 0.1 mL，10%W/V）過(guò)硫酸銨0.1 mL，TEMED 0.004 mL.

配制2 mL 5%濃縮膠：水1.4 mL，30%丙烯酰胺—雙丙烯酰胺0.33 mL，1mol/L Tris（pH 6.8）0.25 mL，10%（W/V）SDS 0.02 mL，l0%（W/V）過(guò)硫酸銨0.02 mL，TEMED 0.002 mL。

1.2.5.3 點(diǎn)樣

將蛋白樣品與2×SDS凝膠加樣緩沖液按1：1混和，沸水中加熱 5 min上樣，每孔加樣20 μL。

1.2.5.4 電泳

連接好電源正負(fù)極導(dǎo)線，80 V恒壓電泳至溴酚蘭進(jìn)入分離膠后，120 V電泳直至指示劑遷移至接近膠底1 cm時(shí)停止電泳。

1.2.5.5 染色與脫色

用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，置室溫?fù)u床搖3～4 h，再將凝膠放入脫色搖床中脫色6～10 h，期間更換脫色液2～3次，觀察蛋白電泳情況。

1.2.6 鞭毛蛋白鏡檢

電鏡負(fù)染試驗(yàn)，采用漂浮法[11]。將提純鞭毛蛋白樣品滴于干凈載玻片上，再將覆有Formvar銅網(wǎng)漂浮于樣品滴上沾取樣品3 min，用鑷子取出后，37 ℃放置干燥15 min，再將銅網(wǎng)漂浮于pH7.0 磷鎢酸液滴染色5 min，用濾紙吸去多余的染液，晾干后，使用電鏡JEM-1200觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法結(jié)果比較

3種方法提取的鞭毛蛋白各20 μL進(jìn)行SDSPAGE，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，酸解法結(jié)合機(jī)械振蕩法提取的綠膿桿菌鞭毛蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示只有一條清晰的蛋白條帶，且蛋白分子量為53 kD，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)得其蛋白濃度為1.0 mg/mL；酸解法提取的綠膿桿菌鞭毛蛋白，為0.53 mg/mL；差速離心法提取的綠膿桿菌鞭毛蛋白，為0.15 mg/mL。

并經(jīng)Quantity one軟件分析可得，酸解法結(jié)合機(jī)械振蕩法提取得到的綠膿桿菌鞭毛蛋白占有率為86.9%（圖1，泳道2），酸解法提取的綠膿桿菌鞭毛蛋白占有率為50.1%（圖1，泳道1），差速離心得到的綠膿桿菌鞭毛蛋白占有率僅為14.6%（圖1，泳道3）。

因此與后兩種方法相比，酸解法結(jié)合機(jī)械振蕩法提取得到的鞭毛樣品中有雜帶出現(xiàn)，說(shuō)明經(jīng)此方法獲得的鞭毛蛋白樣品中含有雜蛋白。

2.2 鞭毛蛋白的鏡檢結(jié)果

經(jīng)酸解法結(jié)合機(jī)械振蕩法得到的鞭毛蛋白樣品做透射電鏡觀察，結(jié)果如圖2所示。

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，該蛋白呈經(jīng)典的絲狀，與其他學(xué)者報(bào)道的鞭毛蛋白形態(tài)相同，說(shuō)明該蛋白就是鞭毛蛋白，且圖中并沒(méi)有明顯的菌體和其他雜質(zhì)的存在，由此可以說(shuō)明經(jīng)酸解法結(jié)合機(jī)械振蕩法得到的鞭毛蛋白是可行的。

3 討論

綠膿桿菌鞭毛為極端鞭毛呈單個(gè)或成對(duì)排列，其鞭毛具有很重要的理化特性，它的免疫原性在生物學(xué)和致病機(jī)制研究中具有重要的意義[12]。在提取鞭毛蛋白時(shí)，需要考慮以下兩個(gè)方面的問(wèn)題：一是培養(yǎng)綠膿桿菌時(shí)鞭毛存在的最佳培養(yǎng)條件，二是綠膿桿菌鞭毛的脫落方法。

實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)菌時(shí)首先采用固體培養(yǎng)基，但后來(lái)發(fā)現(xiàn)有學(xué)者認(rèn)為液體培養(yǎng)基較固體培養(yǎng)基更能刺激細(xì)菌高度增殖和鞭毛蛋白高產(chǎn)，單位質(zhì)量的細(xì)菌可提取更高產(chǎn)量的鞭毛蛋白，所以后來(lái)在培養(yǎng)菌時(shí)多采用液體培養(yǎng)基，且放入恒溫?fù)u床中，轉(zhuǎn)速120 r/min，37 ℃孵育12～16 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這時(shí)段的鞭毛形態(tài)正常，并且用這種方式處理獲取的鞭毛蛋白純度較高。

1988年，Peel就利用菌體細(xì)胞與小玻璃珠產(chǎn)生切力作用使菌體與其鞭毛得到分離，即通過(guò)機(jī)械手段來(lái)完成鞭毛蛋白的提取[13]。Ibrahim等[14]運(yùn)用酸解法獲得高純度的鞭毛蛋白。也有些研究者為追求鞭毛蛋白的產(chǎn)量，使用富含各種蛋白的培養(yǎng)基，于是給純化帶來(lái)麻煩，特別當(dāng)培養(yǎng)基有和鞭毛蛋白分子量接近的蛋白質(zhì)時(shí)，很難使?fàn)I養(yǎng)蛋白完全分離，很難獲得純化的蛋白，酸裂解法各方面的條件也很難控制[15]。本試驗(yàn)對(duì)文獻(xiàn)中提取鞭毛蛋白的方法做了簡(jiǎn)單改良，采用不同的酸堿度使鞭毛蛋白從菌體脫落，并結(jié)合機(jī)械振蕩法，用（NH4）2SO4鹽析獲得鞭毛蛋白，使提取的粗制蛋白相對(duì)較純，后面純化過(guò)程相對(duì)容易，從而得到高產(chǎn)量、高純度的蛋白。

通過(guò)SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以觀察到，目的條指示的分子量為53 kD，另外，通過(guò)在透射電鏡下觀察到的鞭毛蛋白以及SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出利用酸解法結(jié)合機(jī)械振蕩法提取的綠膿桿菌鞭毛蛋白是具有現(xiàn)實(shí)價(jià)值的。

但是，用這種方法提取的鞭毛蛋白還不是很純，總體獲得率不是很高。因此，還需要進(jìn)一步的探索，找到更好的方法獲得大量綠膿桿菌鞭毛蛋白。

綠膿桿菌鞭毛蛋白具有良好的免疫特異性，而且研究表明提取的鞭毛蛋白要比基因克隆表達(dá)的免疫特異性好很多[8]，因此具有十分重要的研究意義，對(duì)進(jìn)一步研究這種鞭毛蛋白在動(dòng)物中的抗原性，制備免疫血清，并分離提純抗原性強(qiáng)的鞭毛蛋白用以構(gòu)建抗病亞單位疫苗，真正為防治綠膿桿菌病提供切實(shí)可用的依據(jù)，為建立水貂養(yǎng)殖病害預(yù)防控制與健康養(yǎng)殖模式，有很強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用前景。

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