呂俊蘭 袁海龍 靳世英 付珊珊 肖小河

中藥日服用次數(shù)是中藥用法的重要內(nèi)容，直接關系臨床的安全性和有效性。目前，許多中藥在臨床上應用時很難確切的規(guī)定服用次數(shù)，一般多憑醫(yī)生經(jīng)驗，每日服用三次較多。但是，這種服用方法是否是最科學的、最有效的，醫(yī)生不敢保證，病人同樣感到疑惑。

本課題組前期針對大黃瀉下及治療實驗性黃疸的日服用次數(shù)做了一定的研究，發(fā)現(xiàn)在規(guī)定的劑量下，大黃以每日服用兩次為佳[1,2]。本文繼續(xù)圍繞以“效”為核心，成分藥動學為輔佐的PD-PK研究模型為研究中心，用蒽醌類成分的整合藥代動力學代替大黃酸的藥代動力學，并采用血清藥理學的方法研究大黃含藥血清體外抗氧化效應動力學，不斷對大黃日服用次數(shù)的研究模式與方法進行探索和創(chuàng)新，以使其早日實現(xiàn)向臨床研究和應用的轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

美國Agilent 1200型高效液相色譜儀；渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，XW-80A)；飛鴿牌離心機(上海安亭科學儀器廠，型號：TGL—16GB)，電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，型號：BAS124S]；酶標儀(奧地利TECAN 公司，型號：Infnite 200)；大黃(購自甘肅省禮縣藥材公司，經(jīng)解放軍第三○二醫(yī)院肖小河研究員鑒定為掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根，批號20080425)；大黃酸，大黃素，蘆薈大黃酸，大黃素甲醚，大黃酚(標準品，中國藥品生物制品檢定所)；甲醇(色譜純，加拿大Promptar有限公司)；乙腈(分析純，北京化學試劑公司，批號080611)；鹽酸(北京化工廠，批號20091010)；純凈水。

1.2 動物與分組

SD大鼠購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院，動物許可證號：SCXK-(軍)2007-004，雄性，體重(220±20)g。將大鼠隨機分為3組，每組8只，記為G1，G2，G3。

1.3 給藥與取血

取大黃粗粉加10倍蒸餾水浸泡30分鐘，煎煮20分鐘，趁熱濾過，殘渣再加入10倍量的蒸餾水，煎煮20分鐘，濾過，合并濾液，減壓濃縮、干燥，粉碎為細粉，臨用前加蒸餾水溶解。G1、G2、G3組分別給予大黃提取物3.6 g/kg，1次/天(給藥時間為早上9：00)，1.8 g/kg，2次/天(給藥時間為9:00和13:00)和1.2 g/kg，3次/天(給藥時間分別為9:00、13:00和17:00)。分別于第一次給藥前(0小時)及給藥后5、10、15、30分鐘，1、2、4、6、8、10、12、24小時由大鼠眼眶后靜脈取血于肝素鈉浸潤過的離心管中，8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分離上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 含藥血清清除超氧陰離子自由基實驗[3，4]

1.4.1 實驗溶液的配制 取2.1 ml濃鹽酸，加蒸餾水定容至250 ml，得到0.1 mol/L的HCl溶液；再稱取三羥甲基氨基甲烷3.0285 g，加蒸餾水溶解，再加入114.5 ml 0.1 mol/L HCl溶液定容至500 ml，得pH=8.2的濃度為50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液；稱取鄰苯三酚1.58 g，用0.1 mol/L的HCl溶液定容至500 ml，得25 mmol/L的鄰苯三酚液。

1.4.2 實驗方法 取pH 8. 2的Tris-HCl緩沖溶液450 μl，置于 25℃水浴中預熱20分鐘，分別加入100 μl血漿樣品和30 μl 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應5分鐘后，加入8 mol/L的HCl溶液100 μl終止反應。自氧化管以100 μl蒸餾水代替樣品管中樣品，操作方法同樣品管，在325 nm處測定吸光值，以等體積pH值8.2的Tris-HCl緩沖液作為空白。計算超氧陰離子的清除率。

式中，A0為自氧化管的吸光值；A1為樣品管的吸光值。

1.5 整合藥代動力學研究

1.5.1 對照品溶液的配制 分別精密稱取大黃酸、大黃素甲醚、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素對照品配制成48 μg/ml、26.8 μg/ml、34 μg/ml、84 μg/ml、20 μg/ml的對照品溶液，再精密吸取上述對照品溶液配制成濃度分別為4.8 μg/ml、5.36 μg/ml、6.8 μg/ml、8.4 μg/ml及2.0 μg/ml的混標溶液。

1.5.2 血漿樣品的處理 吸取200 μl血漿，加入8 mol/L鹽酸沉淀血漿蛋白，渦旋液體混合器上震蕩30秒后，精密加入1 ml乙醚萃取，渦旋混合2分鐘，12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，分離有機相，37℃水浴上氮氣吹干。

1.5.3 高效液相色譜的分析 色譜條件：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(71∶29)；柱溫：30℃；流速：1 ml/min；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μl。血漿樣品按1.5.2項下處理后的殘渣用200 μl的甲醇溶解，進樣分析，記錄五種蒽醌類成分的峰面積，以歸一化法計算相應的血藥濃度。

1.5.4 基于曲線下面積(AUC0-∞)自定義權重系數(shù)的大黃蒽醌整合藥動學模型的建立[5-7]根據(jù)大黃提取物給藥后測得的血藥濃度—時間數(shù)據(jù)，DAS軟件計算藥動學參數(shù)，獲得大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的AUC0-∞數(shù)據(jù)，根據(jù)各成分在5種成分總AUC0-∞中所占比值自定義各成分在綜合濃度中的權重系數(shù)(ωi)，將每一時間點下5種單體成分的血藥濃度賦以各自的權重系數(shù)，求算大黃蒽醌的綜合濃度，進一步進行整合藥動學參數(shù)的研究。大黃蒽醌各成分自定義權重系數(shù)及綜合濃度的計算公式如下：

∑AUC0-∞= AUC0-∞大黃酸
+AUC0-∞蘆薈大黃素+ AUC0-∞大黃素
+ AUC0-∞大黃酚+ AUC0-∞大黃素甲醚

CT=AUC0-∞i×ωi

式中i分別代表大黃酸，蘆薈大黃素，大黃素，大黃酚，大黃素甲醚等五種蒽醌；ωi表示上述成分 AUC0-∞在5種成分總AUC0-∞中的比值；CT為自定義權重系數(shù)校正后大黃蒽醌在大鼠體內(nèi)的綜合濃度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

藥代動力學數(shù)據(jù)采用DAS 2.1.1軟件進行數(shù)據(jù)分析，藥代動力學采用房室模型進行模擬；相關性分析采用SPSS 17.0中的pearson雙變量相關分析進行，P<0.05時認為具有顯著相關性。

2 結果

2.1 抗氧化效應動力學

給予大黃提取物后不同時間點的含藥血清對超氧陰離子(O2·)抑制率的效應動力學曲線見圖1。給予大黃提取物后的含藥血清可明顯抑制超氧陰離子自由基，且不同G1、G2、G3之間具有顯著性差異。借鑒藥代動力學研究中C-T曲線的解析，利用DAS.2.1.1軟件對上述E—T曲線進行房室模型擬合和參數(shù)計算，三組的AUCE分別為649.716、1478.424、988.417，G2>G3>G1。

2.2 大黃五種蒽醌整合藥代動力學研究

將大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚五種蒽醌的血藥濃度—時間數(shù)據(jù)利用DAS 2.1.1進行擬合，得到各自的AUC，再采用基于曲線下面積(AUC0-∞)自定義權重系數(shù)的方法進行大黃五種蒽醌的藥代動力學進行整合，整合后的藥—時曲線及藥代動力學參數(shù)分別見圖2和表1。

圖1 大黃含藥血清清除超氧陰離子的效應動力學曲線

圖2 大黃蒽醌類成分的整合C-T曲線

房室參數(shù)單位參數(shù)值G1G2G3t1/2αh0．3070．91211．487t1/2βh3．4366．37311．489V1/FL·kg-11．1183．6255．828CL/FL·h-1·kg-10．5770．3940．391AUC(0-t)mg·L-1·h17．1924．18822．026AUC(0-∞)mg·L-1·h17．34525．41220．583K10h-10．5160．1090．067K12h-11．08400．007K21h-10．8570．760．06Kah-19．46216．58125．58t1/2Kah0．0730．0420．027Tlagh0．0570．0430．05

G1、G2、G3組的整合Cmax和AUC(0-t)分別為6.02、4.04、3.03和17.19、24.19、22.03，G2組Cmax雖然低于G1，但由于第四小時給與第二次藥后Cmax回升至4.31，因而在24小時內(nèi)AUC(0-t)明顯高于G1，但與G3組差別較小，其相對生物利用度為G2>G3>G1。

2.3 整合藥代動力學與效應動力學的相關性研究

將三組整合后的血藥濃度數(shù)據(jù)與其相應的效應動力學數(shù)據(jù)進行Pearson相關性檢驗，結果見表2。G1、G2、G3組的整合血藥濃度與超氧陰離子抑制率的Pearson相關系數(shù)分別為0.943、0.947、0.853，P值均為0.000，表明整合血藥濃度與抗氧化效應具有顯著的相關性。

表2 整合藥代動力學和效應動力學的Pearson相關性檢驗結果

3 結論與討論

綜合效應動力學和整合藥代動力學數(shù)據(jù)，筆者認為大黃用于抗氧化時以每天服用兩次為佳。從藥效上說，每天服用兩次清除超氧陰離子的AUCE，顯著高于給藥一次和三次組，說明每天給藥兩次時總的抗氧化效應強于每天給藥一次和三次；從五種蒽醌的整合藥代動力學上說，每天給藥兩次組的大黃蒽醌類成分經(jīng)整合后的AUC(0-t)也明顯高于每天給藥一次和三次，兩者結果一致。

現(xiàn)代對中藥的研究主要集中在藥效成分、藥理作用、作用機理等研究領域，這些研究雖然全面而深入，卻始終與臨床研究隔著一條不可逾越的鴻溝，不能直接為臨床服務。如今轉(zhuǎn)化醫(yī)學已成為當前醫(yī)藥學界迅猛發(fā)展的新興領域之一，它強調(diào)基礎研究與臨床應用之間的緊密結合，這種新的醫(yī)學研究模式倡導以患者為中心，從臨床工作中發(fā)現(xiàn)和提出問題，進行深入基礎研究，然后再將基礎研究成果快速應用于臨床，最終惠及廣大患者。中藥日服用次數(shù)與臨床聯(lián)系之緊密，使得它成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學中一個十分重要且不能忽視的關鍵問題，日服用次數(shù)的研究可使基礎研究與臨床醫(yī)療之間建立更直接的聯(lián)系。

中醫(yī)藥的療效評價是轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究的前提，通過獲得療效的證據(jù)，在臨床推廣應用，才能實現(xiàn)從醫(yī)療衛(wèi)生服務及政策制定的后期轉(zhuǎn)化。因此本課題組提出基于以“效”為核心、成分藥動學為輔助(即PD-PK)模型的中藥日服用次數(shù)研究方法[8，9]，更加貼近臨床，彌補了“唯成分論”的不足，適宜于中藥日服次數(shù)的研究。本文對前期建立的中藥日服用次數(shù)的研究方法和模式進行了不斷的探索與創(chuàng)新，尤其是多效應成分的整合藥代動學以及血清藥理學方法的提出和應用，為多組分中藥及中藥復方的研究提供了可靠的基礎。中藥日服用次數(shù)可迅速實現(xiàn)基礎研究到臨床研究及應用的轉(zhuǎn)化，這不僅遵守了“源于臨床，證于實驗，回歸臨床”的研究思路，更為轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究提供了新的研究手段。

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