倪海峰 李 勇 黃光武 施紫光

TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的紊亂與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，RUNX3為TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組成成員，對細(xì)胞的分化、周期調(diào)控、凋亡和惡性轉(zhuǎn)化起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，研究報道包括鼻咽癌在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)RUNX3基因表達(dá)下調(diào)，而近年來研究發(fā)現(xiàn)啟動子高甲基化是RUNX3基因失活的重要機(jī)制，RUNX3基因甲基化與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切，本實驗通過分析RUNX3基因啟動子甲基化與鼻咽癌臨床生物學(xué)行為關(guān)系，探討其在預(yù)測鼻咽癌臨床預(yù)后中的作用。

材料與方法

1.材料:本實驗所有組織標(biāo)本來源于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和杭州市第一人民醫(yī)院自2006～2008年初次確診的患者，20例正常鼻咽上皮組織選用組織來源相同的鼻中隔矯正手術(shù)患者的鼻腔后上段近鼻咽部組織替代，取1例健康青年外周血淋巴細(xì)胞做陽性對照用。54例鼻咽癌標(biāo)本中男性39例，女性15例;年齡20～78歲，平均年齡45.6歲。病理診斷(參照1991年WHO分型):低分化鱗癌48例;未分化癌6例。臨床TNM分期(參照1992年福州分期):TNM分期:Ⅰ期4例，Ⅱ期15例，Ⅲ期23例，Ⅳa期12例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例;咽旁浸潤32例，顱內(nèi)轉(zhuǎn)移18例;遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移0例。

2.方法:(1)DNA的提取:采用DNA提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品)分別從鼻咽癌組織、慢性鼻咽炎癥組織、正常鼻咽上皮組織及外周血白細(xì)胞中提取DNA。(2)外周血DNA的CpG甲基化酶修飾:按甲基化酶試劑盒(NEB公司產(chǎn)品)說明書操作，具體實驗步驟參照文獻(xiàn)［1］。完畢后再進(jìn)行下一步DNA的亞硫酸氫鹽修飾，作為甲基化的陽性對照模板。(3)DNA的亞硫酸氫鹽修飾:將鼻咽癌組織、慢性鼻咽炎癥組織、正常鼻咽上皮組織及外周血淋巴細(xì)胞中提取DNA及經(jīng)CpG甲基化酶處理的DNA分別做亞硫酸氫鹽修飾(所需試劑 Hydroquinone、低熔點瓊脂糖、礦物油、Sodium metabisulphite等為美國Sigma公司產(chǎn)品)，其詳細(xì)的實驗步驟參照文獻(xiàn)［2］。外周血淋巴細(xì)胞中提取DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后用于非甲基化陽性對照模板。(4)甲基化特異性PCR:本實驗引物序列來源于http://genome.ucsc.edu/，RUNX3甲基化特異性引物上游引物序列為5'-TTACGAGGGGCGGTCGTACGCGGG-3'，下游引物為5'-AAAACGACCGACGCGAACGCCTCC-3'，擴(kuò)增片段為220 bp。RUNX3非甲基化特異性引物上游序列為5'-TTATGAGGGGTGGTTGTATGTGGG-3'，下游引物為5'-AAAACAACCAACACAAACAACTCC-3'，擴(kuò)增片段為220bp，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。甲基化特異性PCR程序:95℃預(yù)變性3min，94℃ 30s，59℃ 20s，72℃ 20s 37 個循環(huán)，最后延伸 72℃5min。非甲基化特異性PCR程序:95℃預(yù)變性3min;94℃30s，57℃ 20s，72℃ 20s，37 個循環(huán);最后延伸 72℃ 5min。2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。正常外周血淋巴細(xì)胞DNA做非甲基化陽性對照，CpG甲基化酶修飾后正常外周血淋巴細(xì)胞DNA模板做甲基化陽性對照，水做空白對照。

3.統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，以χ2檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.RUNX3基因的甲基化狀態(tài):陽性(甲基化)標(biāo)本:用甲基化和非甲基化引物擴(kuò)增均有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物;陰性(非甲基化)標(biāo)本:僅有非甲基化引物擴(kuò)增的產(chǎn)物。54例鼻咽癌組織中RUNX3甲基化頻率為59%(32/54)，而慢性鼻咽炎癥組織、正常鼻咽上皮組織均未檢測到RUNX3基因甲基化;3組對照比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)(圖1)。

圖1 RUNX3基因的甲基化狀態(tài)

2.RUNX3基因甲基化與臨床生物學(xué)行為關(guān)系:RUNX3甲基化與鼻咽癌的生物學(xué)行為均無明顯相關(guān)(P＞0.05)(表1)。

討 論

越來越多研究傾向于認(rèn)為鼻咽癌是一種表觀遺傳學(xué)疾病。鼻咽癌表觀遺傳學(xué)改變，尤其是甲基化改變，涉及包括細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡及腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移的全過程［3］。

RUNX3基因位于人染色體1p36.1，全長約67 kb，含有P1、P2兩個啟動子，6個外顯子和1290bp的開放閱讀框，RUNX3基因的轉(zhuǎn)錄主要由啟動子P2操縱。RUNX3是TGF-β信號通路下游的一個重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，引導(dǎo)TGF-β/Smad復(fù)合物從胞質(zhì)轉(zhuǎn)入核內(nèi)特定靶位點，并促使TGF-β/Smad復(fù)合物和靶位點結(jié)合，共同激活靶基因轉(zhuǎn)錄，指導(dǎo)細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡和惡性轉(zhuǎn)化，參與TGF-β對上皮細(xì)胞生長負(fù)性調(diào)控，在TGF-β信號途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］。

表1 鼻咽癌中RUNX3基因甲基化與臨床生物學(xué)行為關(guān)系

近年來研究發(fā)現(xiàn)胃癌、腺樣囊性癌、肺癌、食管癌等惡性腫瘤中存在RUNX3啟動子高甲基化，且異常甲基化是RUNX3基因失活的重要機(jī)制［4～6］。而有關(guān)鼻咽癌中RUNX3基因甲基化及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制研究鮮有報道。張勇等［7］檢測50例鼻咽組織發(fā)現(xiàn)1例RUNX3基因的甲基化，20例慢性鼻咽炎癥組織中未檢測到 RUNX3基因甲基化，并推測鼻咽組織中RUNX3表達(dá)下調(diào)與甲基化無關(guān)。Tan等［8］研究發(fā)現(xiàn)在19例鼻咽組織中沒有檢測到RUNX3基因甲基化。章華等［9］研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中RUNX3蛋白表達(dá)下調(diào)，但下調(diào)機(jī)制未做研究。

然而本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)RUNX3基因在鼻咽癌組織中啟動子甲基化頻率為59%(32/54);在慢性鼻咽炎癥組織和正常鼻咽上皮組織中均未檢測到RUNX3基因啟動子甲基化。表明RUNX3基因甲基化具有腫瘤特異性，RUNX3基因甲基化參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展。本實驗甲基化檢測結(jié)果與Tan及張勇等報道的檢測結(jié)果存在較大差異的原因可能與檢測樣本量、DNA亞硫酸氫鹽修飾方法以及檢測的甲基化位點不同有關(guān)。

Tan等檢測樣本量偏少，檢測的甲基化位點位于第2外顯子區(qū)，使用常規(guī)DNA亞硫酸氫鹽修飾方法，其敏感度和重復(fù)性較差，且同時檢測的其他4個基因(P16、RASSF1A、CDH1、hMLH1)甲基化頻率均明顯低于其他學(xué)者的研究結(jié)果。張勇等［7］檢測樣本量及檢測的甲基化位點(位于P2啟動子區(qū))和本實驗相同，但其使用常規(guī)DNA亞硫酸氫鹽修飾方法敏感度和重復(fù)性較差。目前使用常規(guī)的DNA亞硫酸氫鹽修飾技術(shù)操作復(fù)雜，DNA降解明顯，敏感度和重復(fù)性差，要求DNA量大，從微量組織中檢測非常困難。本實驗采用優(yōu)化的基于瓊脂糖珠包裹的微量DNA亞硫酸氫鹽修飾技術(shù)進(jìn)行DNA的修飾反應(yīng)，可保持DNA于亞硫酸氫鹽敏感的單鏈狀態(tài)，并且免去了DNA純化回收的步驟，大幅度減少了亞硫酸氫鹽修飾反應(yīng)中DNA的降解，從而提高了敏感度，使從微量組織中檢測多基因甲基化成為可能。利用該技術(shù)已經(jīng)能檢測到少至2.5個腫瘤細(xì)胞內(nèi)的多個腫瘤相關(guān)基因的甲基化改變，具有極高的敏感度和特異性。因此本實驗檢測的甲基化的陽性率會偏高。Homma等［10］報道RUNX3基因CpG島從5'區(qū)向轉(zhuǎn)錄起始點方向各位點甲基化的陽性率逐漸降低，本研究檢測的甲基化位點位于P2啟動子區(qū)較Tan等檢測的甲基化位點位于第2外顯子區(qū)更靠近5'區(qū)，因此本實驗甲基化的陽性率會偏高。

綜上分析，本實驗樣本量大于40、采用優(yōu)化的DNA亞硫酸氫鹽修飾技術(shù)及使用位于P2啟動子區(qū)甲基化位點檢測是甲基化的陽性率高的主要原因。腫瘤相關(guān)基因的甲基化，作為一種新的腫瘤分子標(biāo)記，已開始逐漸應(yīng)用于腫瘤的早期診斷、鑒別診斷和判斷預(yù)后、預(yù)測復(fù)發(fā)［11～13］。對舌癌、乳腺癌等［11，12］研究報道RUNX3基因甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤高分期等不良預(yù)后密切相關(guān)，認(rèn)為RUNX3基因甲基化可以作為判斷預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。而本實驗雖然發(fā)現(xiàn)RUNX3基因甲基化更常見于有顱內(nèi)轉(zhuǎn)移、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未分化癌、高T分期及晚期患者，但統(tǒng)計學(xué)分析均無統(tǒng)計學(xué)差異，因此RUNX3基因甲基化目前尚不能作為判斷鼻咽癌臨床預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。

綜上所述，RUNX3基因甲基化參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展，但能否作為判斷鼻咽癌臨床預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)，需要擴(kuò)大樣本研究進(jìn)一步驗證，RUNX3基因甲基化是否是RUNX3基因表達(dá)下調(diào)的重要機(jī)制，有待進(jìn)一步實驗研究證實。

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