王 瑩 李文媛 梁金花 丁 利 趙斯達

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，占耳鼻咽喉科惡性腫瘤7.9%～15.0%，近年來發(fā)生率呈顯著增長趨勢［1，2］。目前趨化因子受體(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)及其配體趨化因子基質(zhì)細胞衍生因子-1(stromal-derived factor-1，SDF-1)相互作用形成的生物軸SDF-1/CXCR4在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用越來越受到人們的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4在乳腺癌、胃癌、食管癌、結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌和口腔癌等多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，能夠促進腫瘤的血管生成，已成為腫瘤血管生成治療的一個新靶點，但關(guān)于SDF-1/CXCR4對腫瘤淋巴管生成的作用尚不明確［3］。血管內(nèi)皮生長因子 -C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)是目前最具代表性的淋巴管生成因子，通過激活淋巴管內(nèi)皮細胞上的受體VEGFR-3可促進淋巴管內(nèi)皮細胞增殖分化并誘導(dǎo)淋巴管生成。為此，本研究探討了SDF-1/CXCR4的表達與喉癌中VEGF-C表達、淋巴管生成和預(yù)后的關(guān)系，為喉癌的診治研究提供新的思路。

材料與方法

1.臨床資料:選取中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科2004年1月～2009年3月首次經(jīng)手術(shù)治療的原發(fā)喉癌患者45例。女性43例，男性2例，平均年齡63.5歲。喉癌位于聲門上者17例，聲門者23例，聲門下者5例。按國際抗癌協(xié)會(UICC)1997年 TNM分期標準，T1N0M0 6例，T2N0M0 6例，T2N1M0 2例，T3N0M0 14例，T3N1M0 9例，T4N0M0 4例，T4N1M0 3例，T4N2M0 1例。有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，淋巴管浸潤8例。隨訪至2009年6月1日，隨訪時間為3～71個月，平均31個月。死亡10例，其中呼吸困難2例，遠處轉(zhuǎn)移4例，其他疾病3例，原因不明1例。對照組20例，均為聲帶息肉手術(shù)切除病例。

2.主要試劑:二甲胂酸鈉，腺苷-5'-磷酸鈉，萘酚ASMX磷酸鈉，左旋咪唑，固藍BB鹽，二甲基甲酰胺(DMF)均購自美國SIGMA公司。SDF-1、CXCR4、VEGF-C抗體及 SP試劑盒均購自北京中杉公司技術(shù)有限公司。Trizol試劑、SuperscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs購自Invitrogen公司，TaqDNA聚合酶、DL2000DNA標志物購自 Takara公司，SDF-1、CXCR4、VEGF-C和β-actin引物由大連寶生物合成。

3.免疫組織化學(xué)染色:嚴格按照免疫組化試劑盒說明的步驟進行，其中一抗?jié)舛?SDF-1(1∶100)、CXCR4(1∶150)、VEGF-C(1:100)。以PBS代替一抗做陰性對照。評分標準按照細胞著色強度(無，0分;弱，1分;中，2分;強，3分)和切片中陽性細胞率評分(≤5%，0分;6%～10%，1分;11%～20%，2分;21%～50%，3分;＞50%，4分)之和為該病例評分值，將評分值≤2分定為陰性，≥3分定為陽性。

4.酶組化染色方法:采用王瑩等［4］報道方法進行酶組化染色方法(5'-Nase法)。淋巴管密度(lymphatic microvessel density，LVD)定量分析:先在低倍鏡下選擇淋巴管最豐富區(qū)域，在高倍鏡下計數(shù)5個視野淋巴管數(shù)，取其均值作為該切片淋巴管數(shù)。

5.統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行處理。計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關(guān)分析采用Spearman檢驗，兩組間LVD比較采用t檢驗，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.SDF-1、CXCR4和 VEGF-C的表達情況:SDF-1、CXCR4和VEGF-C陽性表達位于細胞質(zhì)和胞膜內(nèi)，呈棕黃色顆粒狀(圖1～圖3)。SDF-1、CXCR4和VEGF-C在喉癌組織中的陽性表達率分別為53.3%、35.5%和37.7%，在對照組中的陽性表達率分別為15%、10%和15%，均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.SDF-1、CXCR4和VEGF-C與臨床病理特征的關(guān)系及相關(guān)性分析:在各種臨床因素中，SDF-1和CXCR4蛋白表達均與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤密切相關(guān)(P＜0.05)，而與年齡、性別、腫瘤部位及腫瘤分化程度無相關(guān)性(P＞0.05)。VEGF-C蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴管浸潤密切相關(guān)(P＜0.05)，但與年齡、性別、腫瘤部位、TNM 分期及腫瘤分化程度無相關(guān)性(P＞0.05)(表1)。SDF-1、CXCR4和VEGF-C三者蛋白表達呈正相關(guān)(P＜0.05)(表2)。

3.SDF-1、CXCR4和 VEGF-C與 LVD的關(guān)系:5'-Nase特異性地表達在喉癌組織中毛細淋巴管內(nèi)皮細胞，在光鏡下可見呈棕黃色的點狀(橫切面)或條狀(縱切面，圖 4)，SDF-1、CXCR4和VEGF-C表達均與瘤內(nèi)和瘤周LVD密切相關(guān)(P＜0.05，表 3)。

4.生存率分析:按SDF-1、CXCR4表達的不同將喉癌患者分為兩組，［(-)為陰性，(+)為陽性］，Kaplan-Meier生存分析繪出喉癌患者整體生存曲線，CXCR4陽性表達平均生存時間為(52.8±6.1)個月，陰性表達組平均生存時間為(55.1±4.3)個月，Log rank檢驗表明CXCR4陽性表達與生存率不相關(guān)(χ2=0.284，P=0.498)。SDF-1 陽性表達平均生存時間為(28.5±4.8)個月，陰性表達組平均生存時間為(62.8±3.7)個月，Log rank檢驗表明SDF-1陽性表達生存率顯著低于陰性表達(χ2=11.175，P=0.001)(圖5)。

表1 SDF-1、CXCR4和VEGF-C表達與喉癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

表2 喉癌組織中SDF-1、CXCR4和VEGF-C表達的關(guān)系

表3 喉癌組織中SDF-1、CXCR4和VEGF-C表達與LVD表達的關(guān)系

圖5 喉癌患者整體生存曲線

討 論

SDF-1是骨髓基質(zhì)細胞和成骨細胞所產(chǎn)生的CXC類趨化蛋白，CXCR4是目前已知SDF-1唯一的受體，近年來研究發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4在乳腺癌、胃癌、食管癌、結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌和口腔癌中均能誘導(dǎo)高表達，其高表達與腫瘤細胞存活率和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的增強及患者生存率降低有關(guān)［3］。本研究結(jié)果顯示SDF-1和CXCR4的蛋白在喉癌組織中表達顯著高于對照組，兩者表達均與TNM病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤密切相關(guān)。以上結(jié)果提示SDF-1/CXCR4生物軸能夠促進喉癌的發(fā)生發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Stephan Paget提出了“種子-泥土”假說，指出器官內(nèi)在的特異性性狀與腫瘤的選擇性轉(zhuǎn)移有關(guān)［5］。因此我們推測，CXCR4陽性喉癌細胞(種子)可以有效地誘導(dǎo)SDF-1高表達的腫瘤微環(huán)境，進而誘導(dǎo)喉癌細胞淋巴管浸潤(泥土)，促進喉癌細胞的轉(zhuǎn)移。

最近有報道表明，SDF-1與CXCR4結(jié)合能夠上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達，誘導(dǎo)腫瘤血管生成［6］。但SDF-1/CXCR4軸是否促進腫瘤淋巴管生成尚不清楚。許多研究報道已證實VEGF-C是目前最具代表性的淋巴管生成因子，其表達與多種人類腫瘤淋巴管轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。本實驗發(fā)現(xiàn)，SDF-1/CXCR4與VEGF-C在喉癌組織中有過度表達，又都與淋巴管密度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管浸潤等生物學(xué)特性相關(guān)，而且SDF-1/CXCR4與VEGF-C表達之間顯著正相關(guān)。由此推測SDF-1/CXCR4能夠通過誘導(dǎo)VEGF-C表達上調(diào)，促進喉癌淋巴管生成和淋巴管轉(zhuǎn)移，但其具體作用機制有待于進一步研究。

目前關(guān)于SDF-1和CXCR4表達對腫瘤預(yù)后影響的相關(guān)報道尚不多見，且爭議較多。Liu等［3］研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中CXCR4陽性表達與生存率相關(guān)，但Clatot等［7］研究發(fā)現(xiàn)SDF-1與頭頸部鱗狀細胞癌生存率密切相關(guān)，而CXCR4與生存率不相關(guān)。本實驗結(jié)果表明CXCR4陽性表達與生存曲線不相關(guān)，但SDF-1陽性表達生存率顯著低于陰性表達，與Clatot等觀察結(jié)果相一致。因此，檢測喉癌患者SDF-1蛋白表達將有望成為判斷喉癌預(yù)后的一個新指標。

1 ?，|，王斌全.RECK和MMP-9在喉鱗癌中的表達及其臨床意義［J］. 醫(yī)學(xué)研究雜志，2010，39(4):73-76

2 王瑩，李文媛，孫平，等.ET-1和VEGF-D的表達與喉癌組織淋巴管生成及預(yù)后關(guān)系［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2011，18(11):575-579

3 Liu F，Lang R，Wei J，et al.Increased expression of SDF-1/CXCR4 is associated with lymph nodemetastasis of invasive micropapillary carcinoma of the breast［J］.Histopathology，2009，54(6):741-750

4 王瑩，李文媛，富澤龍，等.喉淋巴管的幾種組織化學(xué)顯色法比較觀察［J］.中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，2008，17(1):70-73

5 Hirakawa S，Detmar M，Kerjaschki D，et al.Nodal lymphangiogenesis and metastasis:role of tumor-induced lymphatic vessel activation in extramammary Paget's disease［J］.Am J Pathol，2009，175(5):2235-2248

6 Shen X，Wang S，Wang H，et al.The role of SDF-1/CXCR4 axis in ovarian cancer metastasis［J］.Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2009，29(3):363-367

7 Clatot F，Picquenot JM，Choussy J，et al.Intratumoural level of SDF-1 correlates with survival in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Oral Oncol，2011，47(11):1062-1068