李棣華，劉俊紅，伍孝先，呂沅珊

（天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所藥物研究室，天津 300100）

柴胡微波輔助提取工藝研究*

李棣華，劉俊紅，伍孝先，呂沅珊

（天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所藥物研究室，天津 300100）

[目的]優(yōu)化微波提取柴胡有效成分的最佳工藝條件。[方法]以常規(guī)回流提取正交結(jié)果為基準(zhǔn)，采用HPLC對(duì)柴胡皂苷成分進(jìn)行監(jiān)測(cè)，優(yōu)化柴胡微波提取的各影響因素。[結(jié)果]優(yōu)選柴胡提取工藝為微波功率800W，以50%乙醇，每次8倍量，提取3次，每次20min。[結(jié)論]表明微波提取技術(shù)法的提取時(shí)間短，效率高，優(yōu)于常規(guī)回流提取方法。

柴胡；柴胡皂苷a、d；微波輔助提取

柴胡性味苦、辛、微寒，歸肝、膽經(jīng)。功能和解退熱、疏肝解郁、升舉陽氣。用于邪在少陽寒熱往來，感冒高熱；肝郁氣結(jié)，脅肋疼痛，月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)；氣虛下陷，久瀉脫肛，子宮脫垂，胃下垂等。為中醫(yī)治療少陽證的首選中藥[1]。

柴胡的化學(xué)成分復(fù)雜，柴胡皂苷a、d等三萜類皂苷為其主要活性成分，具有含量高、生理活性強(qiáng)的特點(diǎn)，藥理實(shí)驗(yàn)證明柴胡皂苷具有抗炎、保肝、抗病毒、降低血中膽固醇和調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等生理活性[2-3]。目前對(duì)其提取多以滲漉、熱回流為主，但這些方法均存在提取率低、能耗高、提取時(shí)間長等缺點(diǎn)。而微波萃取是通過偶極子旋轉(zhuǎn)和離子傳導(dǎo)兩種方式里外同時(shí)加熱，具有穿透力強(qiáng)、受熱均勻、快速、高效的優(yōu)點(diǎn)。故本實(shí)驗(yàn)以柴胡皂苷a、d為指標(biāo)成分對(duì)柴胡的加熱回流提取和微波萃取工藝進(jìn)行了比較研究，為微波技術(shù)在柴胡提取中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器和材料

SSIPC2000型高效液相色譜儀 (美國科學(xué)系統(tǒng)公司)，ORWO8S-2C型微波萃取器 (南京澳潤微波科技有限公司)，十萬分之一電子天平(Sartorius BP211)。柴胡皂苷 a對(duì)照品（批號(hào)：110777-200404）、柴胡皂苷 d對(duì)照品（批號(hào)：110778-200505）購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。柴胡飲片購自河北省安國市隆聯(lián)中藥飲片有限公司（產(chǎn)地山西），由天津中醫(yī)藥大學(xué)黃石渠教授鑒定為傘形科柴胡（Bupleurum chinenseDC.）的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測(cè)定柴胡皂苷

2.1.1色譜條件[4]色譜柱：TEDAChrom C18（4.6mm×250mm，5μm）；檢測(cè)波長：210 nm；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為水，線性梯度洗脫 0～5 min，25%～30%A；5～20 min，30%～40%A；20～35 min，40%～60%A；35～38 min，60%～62%A；38～43 min，62%～25%A；43～48 min，25%～25%A。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取柴胡皂苷a、d各4m g，精密稱定，置于5mL容量瓶中，加甲醇使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液 1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL 進(jìn)樣測(cè)定，分別以兩種對(duì)照品質(zhì)量為縱坐標(biāo)，以峰面積為橫坐標(biāo)值進(jìn)行線性回歸，得兩種對(duì)照品的回歸方程為：柴胡皂苷 a：Y贊=5.41833×10-6X-0.332706，r=0.999 1；柴胡皂苷 d：Y贊=5.268 9×10-6X-0.337 852，r=0.999 1。結(jié)果表明，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d分別在0.830～16.60μg、0.862～17.24μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3 供試品溶液的制備 取提取液適量，揮干，殘?jiān)?%氫氧化鉀正丁醇飽和水溶液20mL轉(zhuǎn)移至分液漏斗內(nèi)，再用水飽和正丁醇萃取3次，每次20mL，合并正丁醇液，揮干，用甲醇轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 樣品測(cè)定 分別吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。

2.5 柴胡常規(guī)回流提取工藝研究 柴胡常規(guī)回流提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量為指標(biāo)，選定乙醇濃度、加醇量、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素，每個(gè)因素分別設(shè)計(jì)3水平，選用L9（34）因素水平表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，方差分析結(jié)果表明，乙醇濃度、加醇量、提取時(shí)間、提取次數(shù)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），同時(shí)考慮節(jié)約能源、時(shí)間等因素，故確定柴胡皂苷提取工藝為：稱取柴胡藥材適量，加8倍量50%乙醇，90℃水浴回流提取3次，每次1 h。用同一批藥材進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，分別按確定工藝條件進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d總量結(jié)果分別為 6.030、6.033、6.081mg/g，平均值6.048mg/g。

3 柴胡微波提取工藝研究

以常規(guī)回流提取篩選的正交結(jié)果為準(zhǔn)，加熱回流提取與微波提取對(duì)溶媒的要求是一致的，故選用50%乙醇做溶媒，對(duì)微波提取相關(guān)因素進(jìn)行考察。

3.1 提取次數(shù)比較 稱取柴胡飲片125 g，各加8倍量50%乙醇，微波輔助提取3次，每次20min，微波功率800W。3次提取液分別過濾，供試品溶液的制備同回流提取項(xiàng)下操作，按色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，結(jié)果提取次數(shù)分別為1、2、3次時(shí)，柴胡皂苷a、d含量分別為3.703、5.322、5.983mg/g。結(jié)果表明提取3次時(shí)效果較好。

3.2 提取時(shí)間比較 稱取柴胡飲片125 g，各加8倍量50%乙醇，微波輔助提取3次，提取時(shí)間設(shè)為3個(gè)水平，微波功率800W。3次提取液過濾，合并，供試品溶液的制備同回流提取項(xiàng)下操作，按色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，結(jié)果提取時(shí)間分別為10、20、30min時(shí)，柴胡皂苷 a、d 含量分別為 5.441、6.032、6.313mg/g。結(jié)果表明提取30min時(shí)效果較好。

3.3 加醇量比較 稱取柴胡飲片125 g，分別加6、8倍量50%乙醇，微波輔助提取3次，每次30min，微波功率800W。3次提取液過濾，合并，供試品溶液的制備同回流提取項(xiàng)下操作，按色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，結(jié)果加醇量分別為6、8倍時(shí)，柴胡皂苷a、d含量分別為6.062、6.313mg/g。結(jié)果表明加8倍量時(shí)效果較好。

故柴胡皂苷微波提取工藝確定為：稱取柴胡藥材適量，加8倍量50%乙醇，微波功率800W，溫度不高于80℃，提取3次，每次30min。（注：微波提取時(shí)間為微波作用時(shí)間；常規(guī)提取時(shí)間為乙醇沸騰時(shí)開始記時(shí)。）

4 微波輔助提取與回流提取的比較

將微波輔助提取工藝與加熱回流提取工藝數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表1，色譜圖見圖1。

表1 微波輔助提取與回流提取結(jié)果對(duì)比Tab.1 Comparison of the resultsofm icrowave-assisted extraction and backflow extraction

由表1可以看出，微波提取在提取時(shí)間方面優(yōu)于常規(guī)回流提取，其他方面相當(dāng)。就提取時(shí)間而言，可節(jié)省時(shí)間50%～70%。而且，在此色譜條件下，微波提取與回流提取指紋色譜峰基本一致，微波提取不影響其有效成分的性質(zhì)。微波提取90min轉(zhuǎn)移率達(dá)到95%以上，但提取60min轉(zhuǎn)移率可達(dá)到91.92%與常規(guī)回流提取率相當(dāng)，同時(shí)考慮到進(jìn)一步節(jié)約時(shí)間，故最終確定微波提取時(shí)間為20min，其他條件不變。

5 討論

微波作用原理具有獨(dú)特性，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，微波提取在節(jié)省時(shí)間、節(jié)約能源、環(huán)保等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，順應(yīng)時(shí)代發(fā)展。

為了驗(yàn)證微波提取與常規(guī)回流提取的區(qū)別，筆者比較了兩種提取方法的HPLC指紋圖譜峰，5個(gè)特征峰一致。此外，還用此兩種提取方法制備的提取液進(jìn)行了大鼠利膽作用的藥效實(shí)驗(yàn)研究[5]，結(jié)果顯示兩種方法的柴胡提取液均能不同程度地增加大鼠膽汁流量,并能明顯增加大鼠膽汁膽紅素的分泌,但以微波提取的柴胡提取液作用更為明顯，進(jìn)一步說明微波技術(shù)在柴胡提取中的可行性。

[1]張?jiān)颇?從少陽樞機(jī)淺析小柴胡湯在三陽病中的應(yīng)用[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（1）：42.

[2]梁 云，崔若蘭.柴胡皂苷及其同系物抗眼和免疫功能的研究進(jìn)展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1998，18（7）：446-447.

[3]陳 爽，賁長恩，楊美娟，等.柴胡皂苷對(duì)肝細(xì)胞增殖及基質(zhì)合成的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，1999，5（5）：21-23.

[4]肖 蓉，王春英，張志斐，等.河北道地藥材北柴胡HPLC-UV指紋圖譜研究[J].中藥材，2006，29（2）：119-123.

[5]卓玉珍，劉俊紅，李棣華，等.不同方法的柴胡提取液對(duì)大鼠的利膽作用研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22（8）：1883.

Technicalstudy onm icrowave-assisted extraction from Radix Bupleuri

LIDi-hua，LIU Jun-hong，WUXiao-xian，LVYuan-shan
（DepartmentofMedicalResearch,Tianjin Instituteof Acute AbolominalDiseasesof Integrated TraditionalChineseandWesten Medicine，Tianjin 300100，Ch ina）

[Objective]Tooptimize the technological conditions for theexaction ofeffective compounds from Bupleurum Chinese DC.by microwave-assisted art.[Methods]Taking the resultsof the routine backflow extraction optimized by an orthogonal testas the standard and using HPLC formonitoring the contentsofsaikosaponin the influence factors formicrowave-assisting extraction from Radix Bulpleuri were optimized.[Results]The optimized extractionsconditionswere:to set themicrowave power rate at800W;to exact three timeswith eight timesvolume ofethylalcohol for20min each time.[Conclusion]The techniquewithmicrowave extraction isbetter than themethod ofbackflow extractionwith high efficiency and shortextraction time.

Bupleurum Chinese DC.；saikosaponin a、d； microwave-assisted extraction

R284.2

A

1672-1519（2012）03-0289-03

天津市衛(wèi)生局中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合科研課題（07017）。

李棣華（1978-），男，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及制劑研究。

2012-01-09）