陳麗萍，薛紅，李景姝，竇林松，李彤

(1．沈陽醫(yī)學院沈洲醫(yī)院呼吸內(nèi)科，遼寧 沈陽 110002；2．沈陽市胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)其發(fā)病機制復雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)不同的人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)等位基因在哮喘的發(fā)病中起抑制作用或為哮喘的易感基因。HLA-Ⅱ類基因在復合體中位于近著絲點一端，命名為HLA-D，其結(jié)構(gòu)最為復雜，至少分為DP、DQ和DR三個亞區(qū)。本實驗采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP)技術(shù)檢測遼寧沈陽地區(qū)漢族人HLA-DPB1等位基因頻率，從免疫遺傳學角度探討支氣管哮喘與HLA-DPB基因相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 研究對象及分組 2009年6月至2011年5月收治于我院呼吸內(nèi)科的支氣管哮喘患者100例，均為輕、中度哮喘患者[1]，男46例，女54例，年齡(50.5±6.2)歲，所有受試者均無茶堿、糖皮質(zhì)激素治療史，靜脈抽血，酶聯(lián)免疫法檢測血總IgE明顯增高。100例健康體檢對照者，男48例，女52例，年齡(48.6±5.7)歲，所有受試者均無吸煙史，近4周內(nèi)無上呼吸道感染史。各組年齡、性別構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。所有入選者均為漢族，長期生活在沈陽地區(qū)(3代或以上)，并除外免疫系統(tǒng)疾病等HLA相關(guān)疾病及家族史。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 Tris、硼酸、EDTA-Na2、SDS(上海試劑廠)；蛋白酶K、DL 1 000 bp Marker、Taq DNA聚合酶、10×Buffer、dNTP (TaKaRa公司)；瓊脂糖、genefinder(華美生物工程公司)。

1.2.2 主要儀器 DNA擴增儀(Biometra，T-gradient)；電泳儀(Pharmacia，ESP 500/400)；電泳槽(北京六一儀器廠，DYY-III33A)； 紫外分光光度計(Unico，2800)；高速臺式離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠，TGL-16G)；低溫冰箱(新飛，BC/BD-625)；恒溫水浴槽(北京六一儀器廠，SY-1220)；紫外凝膠成像分析系統(tǒng)(White/Ultraviolet Trasilliominator，OLYMPIA)。

1.2.3 外周血基因組DNA提取 抽取外周靜脈血0.5 ml，2%EDTA 100 nl抗凝，傳統(tǒng)酚-氯仿法提取基因組DNA。用紫外分光光度計測定DNA含量和純度，根據(jù)A260/A280值計算DNA的含量和純度(吸光度A舊稱光密度OD)。

1.2.4 引物合成 根據(jù)文獻合成PCR擴增引物。

1.2.5 PCR擴增 PCR反應體系：反應總體積20 μl，基因組DNA(濃度10～40 ng/μl)2 μl ，Taq酶0.5 U，dNTPs(200 pmol/μl)1.5 μl，10×PCR Buffer 2 μl，SSP引物，內(nèi)對照引物(濃度1 pmol/μl)各2 μl，無菌去離子水補至20 μl。

PCR反應條件：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 1 min；退火54 ℃ 40 s；延伸72 ℃ 60 s；35個循環(huán)，終末延伸72 ℃ 10 min。

1.2.6 PCR產(chǎn)物檢測 PCR擴增產(chǎn)物加樣至含有g(shù)enefinder核酸染料的1%瓊脂糖凝膠，用50 bp Ladder核酸分子Marker進行對照，在1×TBE緩沖液中進行電泳，電壓110 V，時間45 min。電泳后取出瓊脂糖凝膠，在紫外凝膠成像分析系統(tǒng)上分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計分析應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，基因頻率的計算采用直接計數(shù)法，基因頻率=陽性基因數(shù)/樣本數(shù)×2，各組間等位基因分布比較選用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 質(zhì)量控制 假陰性和假陽性控制：每次PCR反應的DNA基因型別的判定，必須在有清晰的陽性對照(內(nèi)對照)擴增產(chǎn)物帶和陰性對照孔無任何帶型出現(xiàn)的前提下進行。

2 結(jié)果

支氣管哮喘者HLA-DPB1*0201等位基因頻率，PCR擴增結(jié)果在紫外凝膠成像分析系統(tǒng)上顯示，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，在DNA分子Marker 400 bp與450 bp條帶之間，哮喘組和對照組均可見到內(nèi)對照引物的PCR產(chǎn)物帶(429 bp)；在DNA分子Marker 300 bp與350 bp條帶之間，對照組中有25個樣品出現(xiàn)目的基因的PCR產(chǎn)物帶(327 bp)，哮喘組中出現(xiàn)目的基因有4個樣品PCR產(chǎn)物帶。經(jīng)卡方檢驗示兩組比較差異有顯著性(P<0.05)。見表1。

表1 HLA-DPB1 * 0201等位基因出現(xiàn)頻率

3 討論

HLA分子是位于人類第6對染色體短臂(6P)上3 600 kb的一個狹窄區(qū)域內(nèi)，其多態(tài)性最為復雜，其中HLA-Ⅱ類基因靠近著絲點，全長1 000 kb，包括DP、DQ、DR位點。多數(shù)學者認為，哮喘是一種多基因病。國際HLA組及家族基礎(chǔ)的研究證實了HLA-Ⅱ類基因與塵螨誘導的哮喘間的關(guān)系[2]。HLA-Ⅱ類基因是一組免疫應答基因，具有高度多態(tài)性，其基因多態(tài)性決定HLA抗原分子的多態(tài)性，也就決定了HLA系統(tǒng)參與的免疫反應多樣性和復雜性。

由于HLA-Ⅱ類基因表型的多態(tài)性，研究對象的種族差異和實驗方法等原因，世界各地的理論報道不盡相同。國內(nèi)學者高金明等[3]對北京地區(qū)哮喘患者的基因檢測發(fā)現(xiàn)HLA-DQA1*0104和HLA-DQB1*201基因與我國哮喘患者易感性相關(guān)。而HLA-DQA1*0301基因和HLA-DQB1*0301基因則與哮喘的抗性有關(guān)。郭雪君等[4]對上海地區(qū)哮喘患者的基因檢測發(fā)現(xiàn)HLA-DQB1*0303和HLA-DQB1*0601等位基因頻率較正常對照組顯著升高，HLA-DQB1*0201等位基因頻率在對屋塵螨抗原特異性IgE反應哮喘家族成員中有顯著高頻表達。2009年韓國Choi等[5]研究發(fā)現(xiàn)HLA DRB1*1501是甲苯二異氰酸煙鹽獲得性哮喘中的致病基因。Chaporal等[6]研究發(fā)現(xiàn)有關(guān)易感基因的患者，在接觸過敏原的環(huán)境中，有著更高的敏感性，HLA-DQ，DR與哮喘的免疫應答密切相關(guān)。Kalpaklioglu等[7]分析了蟑螂過敏患者與HLA-DRB1*0701等位基因頻率在過敏組明顯升高。

本研究發(fā)現(xiàn)HLA-DPB1* 0201目的基因在哮喘患組的出現(xiàn)頻率低于健康對照組，HLA-DPB1* 0201可能為一種免疫抑制基因，可減少哮喘的發(fā)生，HLA-DPB1等位基因可能通過抑制機體對抗原的應答而降低哮喘的發(fā)病率。我們研究結(jié)果與以往報道的有所不同，可能由于本次實驗研究僅以散發(fā)哮喘患者而非哮喘家系作為研究對象?？赡芘c地域的分布和基因的高度多態(tài)性有關(guān)。從國內(nèi)外一些學者和我們的實驗結(jié)果比較可以看出，由于研究對象的遺傳背景存在很大差異及所選區(qū)域病例有所不同，故實驗結(jié)果可能不太一致；同時支氣管哮喘的臨床表現(xiàn)復雜，為分析哮喘的遺傳特點帶來一定的困難。本實驗從HLA-DPB1*0201這一角度探討了支氣管哮喘的遺傳機制，今后還需進一步擴大樣本量，結(jié)合家系調(diào)查，以家系為基礎(chǔ)的群體分析。本研究為哮喘發(fā)病機制的研究提供理論基礎(chǔ)，同時保護性基因的發(fā)現(xiàn)也為下一步的研究提供了科學依據(jù)。

參考文獻：

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[3]高金明，林耀廣，邱長春，等． 中國北方漢族人群人類白細胞抗原-DQA1 ，HLA-DQB1基因多態(tài)性與支氣管哮喘遺傳易感性的關(guān)系[J]．中華醫(yī)學雜志，2002，82(6)：379-383．

[4]郭雪君，倪培華，李莉，等．HLA-DQ等位基因與哮喘相關(guān)性研究[J ]．中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24(3)：139-141．

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[6]Chapoval SP，David CS． Identification of antigenic epitopes on human allergens： studies with HLA transgenic mice[J]． Environ Health Perspect，2003，111(2)： 245-250.

[7]Kalpaklioglu AF，Turan M． Possible association between cockroach allergy and HLA class Ⅱantigens[J ]． Ann Allergy Asthma Immunol，2002，89 (2)： 155-158．