田力，梁曉鵬，田曉曄，于鑫琛，田晶

(1.沈陽醫(yī)學(xué)院臨床教研室，遼寧 沈陽 110034；2.眼視光學(xué)院；3.鐵嶺經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)靖康康復(fù)養(yǎng)老中心；4.沈陽靖康醫(yī)療集團(tuán))

建立理想的股骨頭缺血壞死動物模型，是研究股骨頭缺血壞死病因及發(fā)病機(jī)制十分重要的手段，也是進(jìn)行股骨頭缺血壞死治療研究的基礎(chǔ)[1]。股骨頭缺血壞死動物模型的造模方法文獻(xiàn)已經(jīng)有很多報道，目前兔股骨頭壞死模型的激素誘導(dǎo)制作方法主要包括連續(xù)兩次注射脂多糖(100 μg/kg)[2]，單劑量靜脈注射脂多糖(10 μg/kg)[3]，連續(xù)多次肌注皮質(zhì)類固醇(4 mg/kg)[4]，大劑量脂多糖聯(lián)合大劑量的皮質(zhì)類固醇，但尚沒有一種能夠快速、高效、低死亡率以及更加接近人早期股骨頭缺血壞死的動物模型。我們在總結(jié)前人成功經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，旨在建立一個能夠真正模擬人早期股骨頭缺血壞死的動物模型，使用小劑量脂多糖(10 μg/kg)聯(lián)合大劑量的地塞米松(25mg/kg)誘導(dǎo)兔股骨頭壞死，通過免疫組化和實(shí)時定量熒光PCR技術(shù)研究了不同時間點(diǎn)兔壞死股骨頭內(nèi)VEGF和Bcl-2基因表達(dá)的動態(tài)變化。

1 材料和方法

1.1 主要儀器及藥品試劑 引物(大連寶生生物工程有限公司)；Trizol Reagent(Invitrogen公司)；DEPC(Sigma公司)；寶生物rTaq酶及配套試劑；ABI9700型PCR擴(kuò)增儀；臺式低溫高速離心機(jī)( Heraeus instruments，德國)；穩(wěn)壓穩(wěn)流定時電泳儀(BIO-RAD，美國)；水平電泳槽(BIO-RAD，美國)；紫外分光光度計(BIO-RAD，美國)；Opticon熒光定量PCR儀(美國MJ Research公司)；SP免疫組織化學(xué)試劑盒(Sigma公司)；寡核苷酸探針雜交試劑盒(武漢博士德公司)；DNaseI(RNase Free，5 U/μl，大連寶生生物工程有限公司)；RNase Inhibitor(40 U/μl，美國Promega公司)；10×Buffer RT(德國Qiagen公司)；dNTP(5 mM，德國Qiagen公司)；Qmmiscript RT(40 U/μl，德國Qiagen公司)；RNase Free water(德國Qiagen公司)；SYBR Green Supermix熒光定量染料(加拿大Bio-Rad Lab)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組與模型制作 30只雄性新西蘭兔，體重2.5～4.0 kg，由沈陽醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組20只，對照組10只。實(shí)驗(yàn)組連續(xù)2天每日經(jīng)耳緣靜脈注射10 μg/kg的脂多糖，再連續(xù)3天每日臀部肌肉注射地塞米松25 mg/kg，對照組注射同等劑量的生理鹽水，所有動物連續(xù)3天每日口飼8萬單位慶大霉素。于造模第4、8、12周，用空氣栓塞法處死后，立即取出雙側(cè)股骨頭，一側(cè)迅速置于液氮罐中保存作實(shí)時定量熒光PCR檢測用。另一側(cè)沿冠狀面剖開，用20倍4%多聚甲醛液固定24 h后脫鈣，常規(guī)脫水包埋切片，分別進(jìn)行免疫組化檢測。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測

1.3.1 總RNA的提取 從液氮中取股骨頭，置于無菌的研缽研成粉末狀后，轉(zhuǎn)入離心管，Trizol試劑加入該管后，按Trizol法的操作規(guī)程提取兔股骨頭總RNA后純化、反轉(zhuǎn)錄。

1.3.2 引物設(shè)計及合成 VEGF上游引物：5’-GTGGACATCTTCCAGGAGTACC-3’；下游引物：5’-GATCCGCATGATCTGCATGGTG-3’；Bcl-2上游引物：5’-GCTACGAGTGGGATACTGGAG-3’；下游引物：5’-ACGGTAGCGACGAGAGAAGT-3’；β-actin上游引物：5’-CGCTGGACTTCGAGCAGGAG-3’；下游引物：5’-CAGGAAGGAGGGCTGGAACA-3’。以上引物均由大連寶生生物工程有限公司合成、純化。

1.3.3 檢測 加入250 ng/μl的cDNA模板2 μl，10 μl SYBR Green熒光染料，上下游引物各0.5 μl，雙蒸水7 μl，每個反應(yīng)體系20 μl，加入定量PCR儀專用毛細(xì)管內(nèi)，放入Opticon熒光定量PCR儀，按如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：95 ℃變性4 min，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，76 ℃ 2 s檢測熒光，共40個循環(huán)。同時，做53～95 ℃范圍內(nèi)的溶解曲線。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，所有資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較使用one-way ANOVA方法統(tǒng)計，兩組均數(shù)之間的比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，多個均數(shù)之間的比較應(yīng)用S-N-K檢驗(yàn)，計數(shù)資料應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。P<為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果 對照組VEGF棕褐色反應(yīng)產(chǎn)物為陽性定位在血管內(nèi)皮細(xì)胞，Bcl-2陽性定位在成骨細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)VEGF和Bcl-2的表達(dá)在造模后第4、8、12周時均為陰性(圖1)。

對照組VEGF陽性實(shí)驗(yàn)組VEGF陰性

對照組Bcl-2陽性實(shí)驗(yàn)組Bcl-2陰性圖1 兩組免疫組化(×400)

2.2 實(shí)時定量熒光PCR結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組在第4、8、12周時，股骨頭內(nèi)VEGFmRNA和Bcl-2mRNA的表達(dá)量均大大低于對照組，差異均有顯著性(P<0.05)(表1，2)。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對照組VEGFmRNA表達(dá)量

注：與對照組比較1)P<0.05

表2 實(shí)驗(yàn)組與對照組Bcl-2mRNA表達(dá)量

注：與對照組比較1)P<0.05

3 討論

股骨頭壞死一般自死骨邊緣和周圍活組織結(jié)合部開始修復(fù)，表現(xiàn)為血管再生，新骨形成和死骨吸收。但隨著修復(fù)向死骨中央推進(jìn)，死骨吸收增強(qiáng)，而血管再生和新骨形成明顯減弱。VEGF能特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，主要作用于血管生成的前一階段，促進(jìn)其增殖和血管生成[5]。Suzuki等[6]已發(fā)現(xiàn)了VEGF可以促進(jìn)股骨頭壞死局部區(qū)域的新生血管形成。Li等[7]用ELISA測量研究表明，地塞米松可以降低骨髓多潛能細(xì)胞株中VEGF蛋白的合成。因此，股骨頭壞死不同時期是否存在VEGF基因表達(dá)的差異仍有待探索。最近一項(xiàng)病例對照研究[8]分析了股骨頭壞死患者與正常人VEGF基因的差異，發(fā)現(xiàn)VEGF基因啟動子643G>C基因型與股骨頭壞死的危險性顯著相關(guān)。Tsu ji等[9]研究了導(dǎo)致凋亡過程中的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在低氧狀態(tài)下細(xì)胞更容易凋亡。他還發(fā)現(xiàn)在低氧并伴有高劑量激素狀態(tài)下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的P53、Bax基因和抑制凋亡的Bcl-2和MDM2基因均下調(diào)，而在氧正常情況下，高劑量的激素可使Bcl-2 基因上調(diào)，他認(rèn)為在低氧狀態(tài)下高劑量激素更易引起凋亡。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，缺氧短期內(nèi)上調(diào)Bcl-2，而較長時間缺氧則使之下調(diào)，加速凋亡進(jìn)程，而轉(zhuǎn)染Bcl-2基因能抑制缺氧誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[10]。Bcl-2作為凋亡抑制蛋白，在一些模型中能抑制MPT孔開放，阻抑cyt-C及凋亡誘導(dǎo)因子釋入胞質(zhì)[12]。Bcl-2高表達(dá)可以完全阻斷復(fù)氧期間cyt-C釋放及caspase-3，9活化而阻止凋亡發(fā)生，即使在缺氧的情況下，Bcl-2高表達(dá)也能保持缺氧/復(fù)氧細(xì)胞線粒體成分完整，促使復(fù)氧期間利用底物而促進(jìn)ATP再生。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體外膜等是ROS產(chǎn)生的重要部位，Bcl-2存在于這些部位，Bcl-2可阻止ROS生成、拮抗H2O2等多種氧化劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這些氧化劑在低濃度時主要通過凋亡途徑殺死細(xì)胞[12]。細(xì)胞凋亡與Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)流入胞質(zhì)有關(guān)，Bcl-2也能阻止這種鈣流而阻抑凋亡發(fā)生。在激素性股骨頭壞死早期，股骨頭局部缺血缺氧進(jìn)一步促使Bcl-2mRNA的表達(dá)下調(diào)加速細(xì)胞凋亡。

實(shí)驗(yàn)中我們直接提取出股骨頭內(nèi)RNA，使股骨頭壞死模型的研究直接得到了較準(zhǔn)確可靠的定量而不僅是定性結(jié)果。并通過免疫組化和實(shí)時熒光定量PCR等技術(shù)檢測且相互印證后所得到的結(jié)果是相互吻合的，即在地塞米松聯(lián)合脂多糖制作的兔股骨頭壞死動物模型中，股骨頭內(nèi)VEGF和Bcl-2的表達(dá)在造模后各時間均受到明顯抑制。

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