李建軍， 王 瑩， 周延清， 李明軍， 李景原

(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南省高校道地中藥材保育及利用工程技術(shù)研究中心 河南 新鄉(xiāng) 453007)

0 引言

地黃(RehmanniagtutinosaLibose)為玄參科多年生草本植物，是常用的補(bǔ)益中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品.主產(chǎn)于河南、河北、山東、山西、內(nèi)蒙古及東北，現(xiàn)全國(guó)大部分地區(qū)有栽培.河南懷慶府是地黃的道地產(chǎn)區(qū)，以溫縣、博愛(ài)、武陟、孟縣等地產(chǎn)量最大.地黃具有滋陰清熱、補(bǔ)血止血等功效，臨床應(yīng)用極為廣泛.由于采收及炮制加工方法及藥效的差異，地黃藥材分為鮮地、生地和熟地.國(guó)內(nèi)外對(duì)其化學(xué)成分、藥理作用的研究已有較多的報(bào)道[1].

迄今為止，對(duì)于地黃的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，尚無(wú)很完善的方法.一直以來(lái)常用梓醇作為地黃尤其是鮮地和生地的指標(biāo)成分進(jìn)行品質(zhì)評(píng)價(jià).2010年版《中國(guó)藥典》把梓醇和毛蕊花糖苷都列為地黃指標(biāo)成分，梓醇作為地黃的主要有效成分之一，具有降血糖、利尿和緩瀉等作用[2-4]；毛蕊花糖苷作為地黃的主要有效成分之一，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)具有明顯的作用，特別是針對(duì)老年癡呆、慢性腎炎等疾病具有明顯的治療作用[5-7].根據(jù)藥典規(guī)定并參考相關(guān)文獻(xiàn)，作者研究了梓醇和毛蕊花糖苷的HPLC測(cè)定方法，進(jìn)行了方法學(xué)考察，取得了比較滿意的結(jié)果，并對(duì)9種主要地黃種質(zhì)資源進(jìn)行了梓醇和毛蕊花糖苷含量的分析比較,為良種繁育推廣和新品種選育提供相關(guān)數(shù)據(jù)支撐[8-9].

1 材料和方法

1.1 材料

2010年11月采自封丘地黃資源圃中，9個(gè)主要種質(zhì)資源經(jīng)河南師范大學(xué)李發(fā)啟副教授鑒定,采用同樣的烘干粉碎方法獲得樣品.

1.2 儀器與試劑

Agilent 1200系列高效液相色譜儀，G1311A四元泵，自動(dòng)控溫自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，F(xiàn)A2004N型電子天平、JH502型電子天平(上海精密科學(xué)有限公司)，Thermo自動(dòng)雙重純水蒸餾器.乙腈、甲醇為色譜純，其他為分析純，水為二次蒸餾水；梓醇標(biāo)樣(蘋壹生物)，毛蕊花糖苷標(biāo)樣(四川維克奇生物科技有限公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 梓醇

2.1.1色譜條件 以乙腈-0.1%磷酸溶液(1∶99)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL.

2.1.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取梓醇對(duì)照品4.65 mg，置5 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻.

2.1.3供試品溶液的制備 精密稱定烘干粉碎后的地黃粉0.8 g，置錐形瓶中，加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10 mL，濃縮至近干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，并用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得.

2.1.4測(cè)定法 對(duì)照品與供試品溶液各進(jìn)樣10 μL進(jìn)行液相色譜分析.按外標(biāo)峰面積法計(jì)算梓醇的含量.

2.3.3 監(jiān)護(hù)時(shí)間 患者在ICU滯留時(shí)間越長(zhǎng)，與外界隔離時(shí)間越長(zhǎng)，ICU環(huán)境及各種社會(huì)心理因素對(duì)患者的刺激就越大，患者由此而產(chǎn)生的不良情緒也越多，其發(fā)生ICU綜合征的概率也就越大。熊澗秋等［21］對(duì)430例體外循環(huán)術(shù)后ICU患者分析表明，滯留時(shí)間≥5 d的289例患者中有76例(26.3%)發(fā)生ICU綜合征，滯留時(shí)間＜5 d的141例患者中有17例(12.06%)發(fā)生ICU綜合征。提示患者滯留時(shí)間越長(zhǎng)，其ICU綜合征發(fā)生率越高。

2.1.5線性關(guān)系 精密吸取上述對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置2 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻.將各個(gè)濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)樣10 μL進(jìn)行液相色譜分析.以梓醇對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，梓醇峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：Y=2 296.3X-19.817，r=0.999 9，梓醇在0.465～4.65 μL線性關(guān)系良好.

2.1.6精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，按含量測(cè)定方法及色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)5次測(cè)定梓醇峰面積，RSD為0.19%.表明儀器精密度良好.

2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液及供試品溶液，于室溫分別放置0、2、4、8、10 h，按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定梓醇峰面積，對(duì)照品及供試品的RSD分別為0.83%和0.76%.結(jié)果表明對(duì)照品及供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.1.8重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批地黃樣品3份，按含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，樣品的梓醇平均含量為1.47%，RSD為3.82%.表明本實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好.

2.1.9數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行計(jì)算和分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示結(jié)果.

2.2 毛蕊花糖苷(麥角甾苷)

2.2.1色譜條件 以乙腈-0.1%醋酸溶液(16∶84)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為334 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL.

2.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取毛蕊花糖苷對(duì)照品8 mg，置50 mL 量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液.

2.2.3供試品溶液的制備 精密稱定烘干粉碎后的地黃粉0.8 g，置錐形瓶中，加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液20 mL，濃縮至近干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得.

2.2.4測(cè)定法 對(duì)照品與供試品溶液各進(jìn)樣10 μL進(jìn)行液相色譜分析.按外標(biāo)峰面積法計(jì)算毛蕊花糖苷的含量.

2.2.6精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，按含量測(cè)定方法及色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)5次測(cè)定毛蕊花糖苷的峰面積，RSD為0.97%.表明儀器精密度良好.

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液及供試品溶液，于室溫分別放置0、2、4、8、10 h，按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定毛蕊花糖苷峰面積，對(duì)照品及供試品的RSD分別為0.047%和0.23%.結(jié)果表明對(duì)照品及供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.2.8重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批地黃樣品3份，按含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，樣品的毛蕊花糖苷平均含量為3.95%，RSD為0.62%，表明本實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好.

2.2.9數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行計(jì)算和分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示結(jié)果.

3 結(jié)果與分析

3.1 同一產(chǎn)地不同地黃種質(zhì)資源產(chǎn)量的比較

在同一產(chǎn)地，分別隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)按行連續(xù)取10株，測(cè)每個(gè)品種的單株鮮重，見(jiàn)圖1.

圖1 不同品種地黃產(chǎn)量比較Fig.1 Comparative studies on the strains of cultivars of Rehmannia

由圖1可知,9個(gè)品種(系)單株產(chǎn)量中，沁懷單株產(chǎn)量最高，且沁懷>北京3號(hào)>生津>懷地3號(hào)>脫毒苗85-5>85-5>懷地1號(hào)>北京1號(hào)>懷地2號(hào).經(jīng)SPSS分析，沁懷與北京3號(hào)差異不顯著，與其他品種差異極顯著，脫毒苗85-5和85-5在產(chǎn)量上差異不顯著.

3.2 同一產(chǎn)地不同地黃種質(zhì)資源樣品中梓醇含量測(cè)定結(jié)果

以同樣的色譜條件分析梓醇標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，得到各樣品的梓醇含量見(jiàn)表1，高效液相色譜圖如圖2所示.

表1 樣品中梓醇含量測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of catalpol content in the samples

由表1可知：9個(gè)地黃樣品梓醇含量差異明顯，其中沁懷最高為3.70%，懷地1號(hào)最低為2.23%，均高于2010年藥典規(guī)定，且沁懷3.70%(對(duì)照)>懷地3號(hào)3.68%(P>0.05)>85-5 3.05%(P<0.01)>生津2.91%(P<0.01)>北京3號(hào) 2.55%(P<0.01)>懷地2號(hào) 2.31% (P<0.01)>脫毒苗85-5 2.30%(P<0.01)>北京1號(hào) 2.25%(P<0.01)>懷地1號(hào) 2.23%(P<0.01);脫毒苗85-5樣品梓醇含量低于非脫毒苗85-5的梓醇含量，且差異極顯著，有關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步研究.由圖2各樣品的色譜圖的峰面積大小，也可以直觀地反映出樣品之間的差異.

3.3 同一產(chǎn)地不同地黃種質(zhì)資源樣品中毛蕊花糖苷含量測(cè)定結(jié)果

以同樣的色譜條件分析毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，得到各樣品的毛蕊花糖苷的含量見(jiàn)表2，高效液相色譜圖如圖3所示.

由表2可知，9個(gè)地黃品種樣品毛蕊花糖苷的含量差異明顯，其中85-5最高為0.13%，北京3號(hào)最低為0.03%，毛蕊花糖苷含量均都高于2010年藥典規(guī)定，且85-5 0.13%(對(duì)照)>北京1號(hào) 0.12%(P>0.05)>懷地2號(hào) 0.10%(P<0.01)=生津0.10%(P<0.01)>懷地3號(hào)0.08%(P<0.01)>懷地1號(hào)0.06%(P<0.01)>沁懷 0.04%(P<0.01)=脫毒苗85-5 0.04%(P<0.01)>北京3號(hào)0.03%(P<0.01)；脫毒苗85-5毛蕊花糖苷含量小于85-5，且差異極顯著，有關(guān)機(jī)理有待進(jìn)一步研究．由圖3各樣品的色譜圖峰面積的大小，可直觀看出樣品之間的差異.

圖2 梓醇的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of catalpol

編號(hào)品種毛蕊花糖苷平均含量/%185-50.13±0.028aA2北京1號(hào)0.12±0.004abAB3北京3號(hào)0.03±0.001eF4生津0.10±0.004cBC5沁懷0.04±0.008deEF6懷地1號(hào)0.06±0.001dDE7懷地2號(hào)0.10±0.003bcBC8懷地3號(hào)0.08±0.007cCD9脫毒苗85-50.04±0.014deEF

圖3 毛蕊花糖苷的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of verbascoside

4 討論

根據(jù)大量文獻(xiàn)報(bào)道，地黃指標(biāo)成分含量差異較大，究其原因是地黃的品種及其生長(zhǎng)環(huán)境、栽培措施、采樣收集時(shí)間及加工炮制方法不同等綜合因素造成的.本實(shí)驗(yàn)將不同種質(zhì)資源栽種在同一塊試驗(yàn)田中統(tǒng)一管理，并參照2010版《中國(guó)藥典》方法及相關(guān)文獻(xiàn)，采用高效液相色譜法測(cè)其成分，以盡量保證各品種的客觀條件基本平行，使測(cè)定結(jié)果更客觀、更真實(shí)地反映不同種質(zhì)資源之間成分含量和產(chǎn)量的差異.

通過(guò)對(duì)地黃同一產(chǎn)地9個(gè)品種(系)的產(chǎn)量試驗(yàn)結(jié)果得出：沁懷>北京3號(hào)>生津>懷地3號(hào)>脫毒苗85-5>85-5>懷地1號(hào)>北京1號(hào)>懷地2號(hào)，從產(chǎn)量方面說(shuō)明沁懷、北京3號(hào)、生津、懷地3號(hào)、脫毒苗85-5和85-5的產(chǎn)量比較高，可以在生產(chǎn)中推廣.

2010年版《中國(guó)藥典》將梓醇和毛蕊花糖苷納入地黃主要指標(biāo)性成分，并規(guī)定地黃中梓醇含量不得少于0.20%，毛蕊花糖苷含量不得少于0.020%.實(shí)驗(yàn)結(jié)果9個(gè)地黃資源樣品梓醇含量范圍在2.23%～3.70%，毛蕊花糖苷含量范圍在0.03%～0.13%.兩種指標(biāo)性成分都遠(yuǎn)高于藥典規(guī)定的最低含量，說(shuō)明懷地黃資源品質(zhì)比較好.

通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可知，地黃不同種質(zhì)資源樣品間指標(biāo)成分含量差異明顯.其中梓醇含量：沁懷最高為3.70%(對(duì)照)>懷地3號(hào)3.68%(P>0.05)>85-5 3.05%(P<0.01)>生津 2.91%(P<0.01)>北京3號(hào) 2.55%(P<0.01)>懷地2號(hào) 2.31% (P<0.01)>脫毒苗85-5 2.30%(P<0.01)>北京1號(hào) 2.25%(P<0.01)>懷地1號(hào) 2.23%(P<0.01),毛蕊花糖苷含量：85-5 0.13%(對(duì)照)>北京1號(hào) 0.12%(P>0.05)>懷地2號(hào) 0.10%(P<0.01)=生津0.10%(P<0.01)>懷地3號(hào)0.08%(P<0.01)>懷地1號(hào)0.06%(P<0.01)>沁懷 0.04%(P<0.01)=脫毒苗85-5 0.04%(P<0.01)>北京3號(hào)0.03%(P<0.01).

綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，地黃產(chǎn)量與其指標(biāo)成分含量之間沒(méi)有相關(guān)性，地黃不同種質(zhì)資源樣品中2個(gè)指標(biāo)成分含量之間沒(méi)有相關(guān)性；85-5、生津、沁懷、懷地3號(hào)和北京1號(hào)都可以作為品質(zhì)育種的親本材料；指標(biāo)成分脫毒85-5明顯低于85-5且差異極顯著，究竟是什么原因造成其次生代謝產(chǎn)物差異的，機(jī)理有待進(jìn)一步研究.

參考文獻(xiàn)：

[1] 張留記，屠萬(wàn)倩．懷地黃品種比較和質(zhì)量研究[J]．河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(3)：101-102．

[2] 王敏，劉紅彥，黃璐琦，等．道地產(chǎn)區(qū)地黃不同品種含梓醇量的比較[J]．中草藥，2002，37(3)：444-446．

[3] Li Junping，Zhou Foujun，Jia Jianwei,et al．Effects of different store time and condition on the contents of catalpol in Rehmannia glutinosa[J]．Chin Tradit Herb Drugs，2003，34(3)：273.

[4] 王太霞，李景原，胡正海．懷地黃營(yíng)養(yǎng)器官中梓醇的積累動(dòng)態(tài)[J]．中草藥，2004，35(2):208-209．

[5] 李勇，孫秀燕，林翠英,等.3個(gè)品種莪術(shù)揮發(fā)油化學(xué)成分的比較[J]．中草藥，2005，36(12)：1785-1787．

[6] 尹明，牟娟，肖華芬,等．HPLC法測(cè)定蜜桶花顆粒中毛蕊花糖苷的含量[J]．中藥新藥與臨床藥理，2008，19(6)：485-487．

[7] Wen Xuesheng，Yang Shiling，Wei Jianhe，et al．Textual research on planting history of Rehmannia glutinosa and its cultivated varieties [J]．Chin Tradit Herb Drugs，2002，33(10)：946-949．

[8] 趙素榮．地黃梓醇提取分離工藝及其生物活性研究[D]．北京：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2006．

[9] 祁建軍．地黃種質(zhì)遺傳關(guān)系及根際土壤微生物多樣性研究[D]．北京：藥用植物研究所，2007．