車宇芳, 葉 飛, 張 泳, 姜 泊，吳本儼

（1解放軍總醫(yī)院南樓臨床部消化內(nèi)科, 北京 100853; 2美國西奈山醫(yī)學(xué)院, 紐約 10029; 3南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院消化內(nèi)科, 廣州 510515）

肝癌是成人最常見的一種肝臟惡性疾病，是目前世界上第五常見的實體腫瘤疾病, 并且高居癌癥死亡的第三位[1]。盡管臨床上有眾多的肝癌治療方法, 包括肝臟移植、外科切除、局部治療, 但是仍有＞70%肝癌患者的預(yù)后不是很理想[2]。幾乎85%肝癌患者在確診時已經(jīng)不能進(jìn)行根治性治療, 而只能給予保守治療, 比如肝動脈插管化療、射頻治療、化療等[3]。耐受性好、效率高的治療方法將是未來肝癌治療發(fā)展的新方向[4]。

在腫瘤細(xì)胞中, 細(xì)胞周期素依賴激酶（cyclin dependent kinase, CDK）功能的失調(diào)控是一種常見的現(xiàn)象。鑒于這種原因, 影響CDK表達(dá)的化合物flavopiridol和其他一些新興化學(xué)合成物得到了很好的發(fā)展[5]。Flavopiridol是來源于Amoora rohituka和Dysoxylumbinectariferum根莖的一種半合成黃酮類物質(zhì)[6], 它可以有效抑制人癌細(xì)胞株中CDK1、CDK2、CDK4、CDK7的表達(dá), 并且引起一系列細(xì)胞毒性, 導(dǎo)致細(xì)胞周期G1-S和G2-M期阻滯[7,8]。最近, flavopiridol對慢性淋巴細(xì)胞白血病治療已經(jīng)進(jìn)入了Ⅱ期臨床試驗[9,10],但是關(guān)于其在肝癌治療方面的報道卻很少。本次研究目的在于了解flavopiridol是否可以影響肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期, 從而為其將來應(yīng)用于肝癌治療奠定生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料和試劑

細(xì)胞培養(yǎng)試劑DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗均購自Invitrogen公司; flavopiridol購自Sigma-Aldrich公司; CDK4抗體, CDK6抗體,cyclinD1抗體, α-tubulin抗體購自Santa Cruz公司; 羊抗兔和羊抗鼠HRP抗體購自Bio-Rad公司; BCA蛋白檢測試劑盒購自Pierce公司; 細(xì)胞計數(shù)試劑盒購自碧云天生物公司; 細(xì)胞周期試劑盒購自凱基生物公司; TACSTMAnnexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自R&D公司; 蛋白提取液購自Sigma公司;Super SignalRWest Pico Trial化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購于Pierce公司, 細(xì)胞培養(yǎng)孔板均購自Corning公司;其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純和生物化學(xué)試劑。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

肝癌Huh7細(xì)胞株購自ATCC細(xì)胞庫, 為南方醫(yī)院消化病研究所細(xì)胞培養(yǎng)室保存。細(xì)胞株37 ℃ , 5% CO2培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中。

1.3 細(xì)胞增殖分析

96孔板每孔加入Huh7細(xì)胞2000個/100 μl , 培養(yǎng)過夜后, 給予flavopiridol 150, 250, 350, 450, 550 nmol/L進(jìn)行處理, 分別孵育 24, 48 h后, 每孔加入 10 μl CCK-8溶液, 在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h, 450 nm測定吸光度。實驗設(shè)置3個復(fù)孔。

1.4 細(xì)胞凋亡分析

6孔板種植Huh7細(xì)胞, 培養(yǎng)過夜后使得細(xì)胞融合度達(dá)到 30%～50%, 給予 flavopiridol 150, 350,550 nmol/L, 處理24 h后收集細(xì)胞, PBS離心洗滌2次, 棄去上清, 將細(xì)胞沉淀懸于 200 μl Annexin-VFlous標(biāo)記液中, 并轉(zhuǎn)移到流式細(xì)胞儀試管中, 室溫下避光孵育 15 min, 流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞。運用CellQuest Program進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析, 實驗重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞周期分析

6孔板種植Huh7細(xì)胞, 培養(yǎng)過夜后使細(xì)胞融合度達(dá)到30%～50%, 給予flavopiridol 150, 350, 550 nmol/L,處理24 h后收集細(xì)胞, PBS離心洗滌2次, 棄去上清,于細(xì)胞沉淀中加入200 μl 碘化丙啶溶液混勻, 室溫下避光孵育 30 min; 利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣品收集,運用 CellQuest Program進(jìn)行細(xì)胞周期分布的分析,實驗重復(fù)3個復(fù)孔。

1.6 Western-blot檢測

1.6.1 細(xì)胞總蛋白的提取和定量 對 Huh7細(xì)胞分別給予flavopiridol 150, 350, 550 nmol/L劑量處理, 處理后提取細(xì)胞蛋白; 應(yīng)用 BCA法測定蛋白濃度。

1.6.2 Western-blot檢測 5%脫脂奶粉/TBS-T稀釋α-tubulin抗體（1︰1000）、cyclinD1抗體（1︰500）、CDK4抗體（1︰500）、CDK6抗體（1︰500）, 與PVDF膜4℃孵育過夜, TBS洗滌3×3 min, TBS-T洗滌2×3 min。加入相應(yīng)二抗, 與PVDF膜室溫孵育1 h, TBS-T洗滌3×5 min, TBS洗滌3×8 min。SuperSignalRWest Pico Trial化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進(jìn)行蛋白信號的檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

所有結(jié)果均經(jīng)SPSS12.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計。細(xì)胞增殖、凋亡、周期實驗采用單向方差分析方法進(jìn)行比較, 方差不齊時用Welch校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Flavopiridol對Huh7細(xì)胞增殖的影響

Flavopiridol 150, 250, 350, 450, 550 nmol/L處理Huh7細(xì)胞24 h和48 h后, 結(jié)果顯示, 隨著flavopiridol處理劑量的增加, 細(xì)胞數(shù)目逐漸減少; 處理 24 h和48 h不同劑量組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）, 說明flavopiridol可以顯著抑制Huh7細(xì)胞增殖（圖1）。

2.2 Flavopiridol促Huh7細(xì)胞凋亡的作用

Flavopiridol 150, 350, 550 nmol/L處理Huh7細(xì)胞24 h后, 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明,flavopiridol可以引起Huh7細(xì)胞發(fā)生凋亡, 凋亡細(xì)胞從空白對照組的2.65%升高到550 nmol/L劑量處理組的14.17%（P＜0.01; 圖 2）。

2.3 Flavopiridol對Huh7細(xì)胞周期的作用

Flavopiridol 150, 350, 550 nmol/L 處理Huh7細(xì)胞 24 h后, 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況, 結(jié)果表明, flavopiridol可以引起Huh7細(xì)胞G1期阻滯,G1細(xì)胞從空白對照組51.06%升高到550 nmol/L劑量處理組的57.53%（P＜0.01; 圖3）。

圖1 不同濃度flavopiridol處理Huh7細(xì)胞不同時間點后對細(xì)胞增殖率的影響Figure 1 Huh 7 cells viability after flavopiridol treatments at different concentration and time points

圖2 不同濃度flavopiridol處理Huh7細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡情況Figure 2 Huh7 cells apoptosis after flavopiridol treatment at different concentration

圖3 不同濃度flavopiridol處理Huh7細(xì)胞24 h后的細(xì)胞周期分布情況Figure 3 Cell cycle distribution of Huh7 cells after flavopiridol treatment at different concentration

2.4 Flavopiridol抑制細(xì)胞CDK4, CDK6和cyclinD1表達(dá)

Flavopiridol 150, 350, 550 nmol/L處理Huh7細(xì)胞后收集細(xì)胞, 提取蛋白, Western blot方法檢測CDK4、CDK6和 cyclinD1的表達(dá)情況。結(jié)果表明,flavopiridol可抑制CDK4, CDK6和cyclinD1表達(dá), 并且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng), 表明flavopiridol可能是通過下調(diào)CDK4, CDK6和 cyclinD1表達(dá)而引起細(xì)胞G1期阻滯, 從而抑制Huh7細(xì)胞增殖（圖4）。

3 討 論

肝癌是世界上最常見的癌癥之一, 每年大約有50萬到 100萬患者死于肝癌[11]。雖然外科手術(shù)切除和肝臟移植被視為根治性的治療方法, 但是80%肝癌患者在確診時病灶已經(jīng)擴(kuò)散, 不能進(jìn)行外科治療[12]。所以, 進(jìn)行有效的化療, 是提高肝癌患者預(yù)后的重要方法之一; 而研發(fā)新的、有效的化療藥物將是未來肝癌治療發(fā)展的方向。

圖4 不同濃度flavopiridol處理Huh7細(xì)胞24 h后CDK4,CDK6, cyclinD1的表達(dá)Figure 4 Protein level of CDK4, CDK6 and cyclinD1 in Huh 7 cells after flavopiridol treatment at different concentration

Flavopiridol, 是一種半合成黃酮類物質(zhì), 可以在許多人類癌細(xì)胞株中引起細(xì)胞G1-S期和G2-M期阻滯, 在慢性淋巴細(xì)胞白血病治療方面已經(jīng)進(jìn)入了Ⅱ期臨床實驗[7-10]。但是, 對于flavopiridol是否可以應(yīng)用于肝癌患者的治療仍不是很清楚。在本研究中,應(yīng)用flavopiridol處理Huh7細(xì)胞, 觀察其對細(xì)胞生物學(xué)特性的影響, 可為未來肝癌治療提供新的方向。

本次研究提示, 應(yīng)用 flavopiridol處理 Huh7細(xì)胞株, 可劑量依賴性抑制肝癌細(xì)胞增殖; 細(xì)胞凋亡和周期檢測顯示, flavopiridol處理Huh7細(xì)胞后, 可顯著引起細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期 G1期阻滯, 這與近來flavopiridol可引起細(xì)胞凋亡和G1期阻滯的研究一致[13,14]; 另外, 在 flavopiridol處理 Huh7細(xì)胞后,我們進(jìn)行了細(xì)胞周期G1期相關(guān)蛋白CDK4, CDK6和cyclinD1表達(dá)檢測, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), flavopiridol可以抑制CDK4, CDK6, cyclinD1的蛋白表達(dá)。

總之, 本研究證明, flavopiridol可能通過抑制肝癌細(xì)胞 CDK4/CDK6/cyclinD1復(fù)合物表達(dá)水平,引起細(xì)胞G1期阻滯, 同時促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 從而抑制了肝癌細(xì)胞的增殖。未來可以將flavopiridol應(yīng)用于肝癌患者治療的生物學(xué)研究當(dāng)中, 進(jìn)而為肝癌治療提供新的發(fā)展方向。

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