孫磊 吳波 田敏 劉百川 羅永忠

中國人民解放軍第八十八醫(yī)院全軍骨科中心（山東 泰安 271000）

前交叉韌帶 （anterior cruciate ligament，ACL）損傷是常見膝關(guān)節(jié)損傷之一，常需手術(shù)重建。ACL重建研究熱點(diǎn)主要著重于兩方面，一是解剖學(xué)，二是生物學(xué)。解剖學(xué)方面基于對ACL解剖與生物力學(xué)特點(diǎn)的認(rèn)識，設(shè)計ACL的重建技術(shù)方法，力求恢復(fù)ACL原有的尺寸、韌帶走行方向和止點(diǎn)位置[1]。而生物學(xué)方面則關(guān)注ACL重建移植物與宿受區(qū)的愈合，無論采用何種重建移植物，只有移植物與宿主受區(qū)生物愈合，才能長久替代ACL功能。移植物關(guān)節(jié)內(nèi)部分的愈合又稱為“韌帶化”，是一復(fù)雜的過程，移植物關(guān)節(jié)內(nèi)部分要經(jīng)歷缺血壞死、再血管化、組織細(xì)胞增殖和塑型成熟4個階段[2-4]。許多學(xué)者認(rèn)為，原始ACL的殘跡是ACL重建后移植物的再血管化、細(xì)胞增殖和神經(jīng)再生的重要源泉[5，6]，因此，主張保留殘跡 ACL重建的手術(shù)方法已有許多臨床研究報道[7，8]，但鮮有相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)研究[9-11]。本研究假設(shè)保留殘跡可加快ACL重建移植物的再血管化和修復(fù)愈合過程，促進(jìn)移植物的“韌帶化”，建立保留與切除殘跡兔ACL重建模型，觀察比較兩種ACL重建方式移植物愈合過程的形態(tài)學(xué)差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與處理

4～6月齡健康新西蘭兔30只，體重（2.62±0.24）kg，雌、雄各14只，由泰安米歇爾生物公司實(shí)驗(yàn)動物中心提供。本研究主要工作在我院中心實(shí)驗(yàn)室完成，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（軍）2007-02。10%水合氯醛，2.5 ml/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺上。分別于跟腱外側(cè)切開，切取跟腱外側(cè)2/3，作為移植腱，將移植物修整至長5 cm，直徑2.0 mm。兩端編織縫合，保留尾線作為牽引線，置于生理鹽水中備用。于膝關(guān)節(jié)外側(cè)切開，將髕骨翻向內(nèi)側(cè)，顯露關(guān)節(jié)，切斷前交叉韌帶。右膝為保留殘跡組（remnant preservation，RP），保留股骨端和脛骨端各2 mm長的殘跡；左膝為切除殘跡組（remnant resection，RR），采用燒灼法完全切除上下端殘跡。定位于原ACL殘跡或印跡中央，用直徑為2.0 mm的鉆頭，分別由外向內(nèi)鉆脛骨和股骨隧道。分別將移植物引入，拉緊移植物，于骨隧道外口處將移植腱與周圍軟組織縫合固定。檢查見移植物張力適中，兩端固定牢固，逐層縫合切口。術(shù)后后肢不予固定，分籠飼養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表將30只動物分為3組，每組10只，分別于術(shù)后4、8、12周行膝關(guān)節(jié)功能評分；處死動物后，行血管灌注大體形態(tài)觀察與組織學(xué)觀察。

1.2 觀測指標(biāo)

1.2.1 膝關(guān)節(jié)功能評分

按膝關(guān)節(jié)被動活動缺失、跛行程度、前抽屜試驗(yàn)穩(wěn)定性進(jìn)行評分，詳見表1，最低得0分，最高9分。

表1 膝關(guān)節(jié)功能評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 血管灌注及大體形態(tài)觀察

10%水合氯醛過量麻醉處死動物。開胸暴露心臟，直視下將注入管插入左心室，流出管插入右心房。首先灌注肝素生理鹽水，灌注機(jī)轉(zhuǎn)速180 r/min，當(dāng)流出管液變清時，開始灌注4%甲醛500 ml，然后，再注入甲醛炭素墨水500 ml后停止。切開膝關(guān)節(jié)，觀察重建ACL移植物大體形態(tài)與表面血管情況。清除膝關(guān)節(jié)周圍關(guān)節(jié)囊、其他韌帶和筋膜等，5倍解剖顯微鏡下采集重建ACL前、后、左、右4幅圖像，輸入計算機(jī)，Image-Pro Plus 6.0軟件圖像處理，分別計算重建ACL關(guān)節(jié)內(nèi)段移植物表面血管面積和移植物面積（像素數(shù)），移植物表面血管密度=移植物表面血管面積/移植物面積。取4幅圖像的平均值。

1.2.3 組織形態(tài)觀察與評分

切取重建ACL移植物關(guān)節(jié)內(nèi)中央5 mm段，10%多聚甲醛固定、10%EDTA脫鈣。修整標(biāo)本，脫水、透明、浸蠟、包埋，制備移植物中央部縱向5 μl的切片，分別行HE和Masson三色染色。在切片中央連續(xù)選取4個高倍鏡視野 （×400），2名病理學(xué)醫(yī)生在雙盲條件下按表2分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)評分，取兩人各4個視野的平均值。

表2 高倍鏡下移植物中央部組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)（×400）

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

資料輸入計算機(jī)，采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各時間點(diǎn)內(nèi)兩處理組間計量資料分別行配對t檢驗(yàn)，等級資料分別行配對Wilcoxon符號等級檢驗(yàn)。整體資料采用2×3析因方差分析。選取α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膝關(guān)節(jié)功能評分

表3顯示，術(shù)后各時間點(diǎn)保留殘跡組膝關(guān)節(jié)功能評分均高于切除殘跡組，但兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。2×3析因分析表明：保留殘跡組和切除殘跡組間膝關(guān)節(jié)功能評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.800，P=0.185）；不同時間點(diǎn)間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.956，P=0.061）；移植處理與時間之間無交互作用（F=0.200，P=0.891）。

表3 兩組術(shù)后各時間點(diǎn)膝關(guān)節(jié)功能評分比較（）

表3 兩組術(shù)后各時間點(diǎn)膝關(guān)節(jié)功能評分比較（）

n ????? ????? Z? P?4? 10 7.90–0.88 7.70–1.06 0.7070.4808? 10 8.10–0.74 7.90–0.99 0.3510.72612? 10 8.70–0.48 8.10–0.92 1.3940.163

2.2 術(shù)后大體形態(tài)觀察及移植物表面血管密度

術(shù)后4周，保留殘跡組ACL殘跡與移植物愈合，可見較多自殘跡表面向移植物表面延伸的血管，殘跡與移植物的邊界清晰可辨，未見殘跡形成“獨(dú)眼畸形”；切除殘跡組表面有少量新生血管。

術(shù)后8周，保留殘跡組（圖1a）小箭頭示ACL殘跡與移植物融合塑型，邊界已模糊不清，無“獨(dú)眼畸形”，大箭頭示移植物表面有密集新生血管；切除殘跡組表面新生血管較稀疏（圖1b）。

術(shù)后12周，保留殘跡組移植物塑型為近似ACL的結(jié)構(gòu)，表面血管減少，難以分辨移植物與殘跡，殘跡已吸收，不可分辨（圖1c）；切除殘跡組移植物亦有塑型改建，表面血管稀疏（圖1d）。

表4顯示，術(shù)后不同時間點(diǎn)保留殘跡組移植物表面血管密度均高于切除殘跡組；4、8周時，兩組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），12周時，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。2×3析因分析表明：保留殘跡組與切除殘跡組之間移植物表面血管密度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=32.037，P<0.001），不同時間點(diǎn)對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （F=59.596，P<0.001）。移植處理與時間不存在顯著交互作用（F=2.448，P=0.096）。

表4 兩組術(shù)后各時間點(diǎn)移植物表面血管密度比較（）

表4 兩組術(shù)后各時間點(diǎn)移植物表面血管密度比較（）

n ????? ????? t? P?4? 100.02912–0.001410.01606–0.007334.1570.0028? 100.04242–0.008050.03129–0.007402.8360.02012? 100.01706–0.005170.01269–0.005902.0030.076

2.3 組織學(xué)形態(tài)觀察

術(shù)后4周，保留殘跡組外周部（P）有大量新生血管和成纖維細(xì)胞，但中央部（C）新生血管和成纖維細(xì)胞數(shù)目較少（圖2a），膠原纖維排列稍紊亂，密度較低，但仍呈波紋狀排列（圖2b）；相比之下，切除殘跡組移植物外周部亦可見新生血管和成纖維細(xì)胞增生，但侵入移植物中央部的成纖維細(xì)胞更為稀少（圖2c），膠原纖維排列更紊亂，更稀疏，未見波紋狀排列（圖 2d）。

圖1 術(shù)后8周和12周移植物血管染料灌注大體形態(tài)

圖2 術(shù)后4周組織學(xué)檢查所見（×100）

術(shù)后8周，保留殘跡組移植物內(nèi)可見密集新生血管，伴有大量成纖維細(xì)胞增生，膠原纖維密度增加，但排列仍不規(guī)整；切除殘跡組移植物內(nèi)也有較多新生血管，成纖維細(xì)胞增生，膠原纖維密度有所增加，排列紊亂。

術(shù)后12周，保留殘跡組移植物中央部新生血管密度減少，管腔增粗，成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯減少，膠原纖維致密，排列趨于規(guī)整；切除殘跡組移植物中央部血管細(xì)小，成纖維細(xì)胞數(shù)量亦減少，膠原纖維較致密，排列欠規(guī)整。

表5顯示，術(shù)后不同時間點(diǎn)，保留殘跡組移植物中央部組織學(xué)評分均高于切除殘跡組，4周、8周兩組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但12周兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。2×3析因分析表明：保留殘跡組與切除殘跡組之間組織學(xué)評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.150，P<0.001），不同時間點(diǎn)對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=67.817，P<0.001）。移植處理與時間不存在顯著交互作用 （F=2.475，P=0.094）。

表5 兩組術(shù)后各時間點(diǎn)高倍鏡下移植物中央部組織學(xué)評分比較（×400）（）

表5 兩組術(shù)后各時間點(diǎn)高倍鏡下移植物中央部組織學(xué)評分比較（×400）（）

n ????? ????? Z? P?4? 10 4.00–0.67 2.80–0.92 2.203 0.0288? 10 7.60–1.07 5.90–1.29 2.459 0.01412? 10 6.60–0.70 6.20–0.79 1.000 0.317

3 討論

功能評分是臨床評價ACL重建效果的重要方法，主要有Lysholm評分、Tegner評分、IKDC主觀評分與客觀評級[12]。本研究對象為兔，無法進(jìn)行主觀評定。故我們依據(jù)容易觀察的關(guān)節(jié)被動活動缺失、跛行程度、前抽屜試驗(yàn)穩(wěn)定性三項客觀指標(biāo)進(jìn)行評分，盡管不夠精細(xì)，但可提供量化的膝關(guān)節(jié)功能信息。結(jié)果表明，雖然保留殘跡組與切除殘跡的功能評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但保留殘跡組功能評分有高于切除殘跡組的趨勢。這可能與保留殘跡組ACL重建對關(guān)節(jié)內(nèi)組織的干擾與損傷較輕有關(guān)，提示采用保留殘跡技術(shù)重建ACL，減少對關(guān)節(jié)內(nèi)組織的清創(chuàng)，有可能減輕術(shù)后局部反應(yīng)，有利于術(shù)后早期功能恢復(fù)。

大體形態(tài)觀察是評價移植物關(guān)節(jié)內(nèi)愈合最直觀的方法，臨床多采用二次關(guān)節(jié)鏡下觀察評估[13，14]。 本研究為動物實(shí)驗(yàn)，在術(shù)后不同時間點(diǎn)再次切開關(guān)節(jié)進(jìn)行細(xì)致觀察。大體觀察可見保留殘跡組ACL殘跡與移植物愈合，并逐步塑型融合，可見較多自殘跡表面向移植物表面延伸的血管，未見殘跡形成“獨(dú)眼畸形”。獨(dú)眼畸形是由于殘跡纖維與髁間窩反復(fù)撞擊以及脛骨隧道口周圍軟骨和骨碎屑沉積而增生形成纖維結(jié)節(jié)樣包塊，從而導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)伸直功能受限[15]。本研究結(jié)果進(jìn)一步佐證了 Cha 等[16]、Ahn 等[17]的臨床研究結(jié)果，保留殘跡ACL重建并未增加“獨(dú)眼畸形”的發(fā)生。ACL重建移植物的再血管化是其愈合的關(guān)鍵過程，在關(guān)節(jié)內(nèi)段，再血管化由兩邊向中央，由淺入深地發(fā)展。以往對移植物再血管化的研究主要采用組織學(xué)觀察[18，19]。 李志超等[11]研究保留殘跡 ACL重建的再血管化，采用了血管染料灌注后組織學(xué)觀察，并未進(jìn)行移植物表面血管再生的大體觀察。本研究將血管染料灌注后大體形態(tài)與組織學(xué)觀察相結(jié)合，更全面評估移植物的再血管化。結(jié)果顯示，術(shù)后保留殘跡組血管密度均顯著高于切除殘跡組，4周和8周時兩組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。這提示原始ACL殘跡是ACL重建移植物再血管化更直接的來源。換言之，保留殘跡的ACL重建更有利關(guān)節(jié)內(nèi)移植物的再血管化。

筆者[9]以往對保留殘跡ACL重建的移植物組織學(xué)觀察，李志超等[11]的研究主要以移植物內(nèi)成纖維細(xì)胞計數(shù)評估移植物的韌帶化進(jìn)程，但ACL重建后關(guān)節(jié)內(nèi)移植物愈合的組織學(xué)改變是一復(fù)雜的過程。王永健等[20]的研究表明，移植手術(shù)后第2周，可見關(guān)節(jié)腔內(nèi)的肌腱組織壞死，表現(xiàn)為細(xì)胞核溶解，新生組織尚未長入替代；術(shù)后1月，見到有大量新生的細(xì)胞從移植物外周向中心長入，新生細(xì)胞呈梭形，較正常半腱肌腱和前交叉切帶細(xì)胞的體積大；術(shù)后第2個月，關(guān)節(jié)腔中的移植物富含細(xì)胞，呈類圓形，膠原纖維排列無序；術(shù)后第4個月，移植物中細(xì)胞數(shù)目接近正常前交叉切帶，細(xì)胞呈長梭形，膠原纖維縱向排列比較整齊。故本研究設(shè)計了組織學(xué)評分系統(tǒng)，依據(jù)高倍鏡視野下新生血管計數(shù)、成纖維細(xì)胞計數(shù)和膠原纖維密度來綜合評價移植物愈合程度。結(jié)果表明，術(shù)后不同時間點(diǎn)，保留殘跡組中央部組織學(xué)評分均高于切除殘跡組，4周和8周時兩組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，但12周時兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究組織學(xué)結(jié)果與血管灌注大體觀察所見吻合，提示保留殘跡ACL重建可早期促進(jìn)關(guān)節(jié)內(nèi)移植物的愈合。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)了筆者假設(shè)，保留殘跡可加快ACL重建移植物的再血管化和修復(fù)愈合過程，促進(jìn)移植物的韌帶化。這歸結(jié)于殘跡為移植物愈合提供細(xì)胞、血管和神經(jīng)再生的源泉。此外，在移植物再血管化這一關(guān)鍵過程中，局部血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）等的表達(dá)具有重要作用[21，22]。Xie 等[23]比較了保留殘跡、切除殘跡ACL重建，以及假手術(shù)和正常ACL生長因子基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)術(shù)后6周保留殘跡組的COL1A1、COL3A1、TGF-β1和神經(jīng)相關(guān)基因GAP-43表達(dá)均高于切除殘跡組，術(shù)后12周保留殘跡組VEGF mRNA水平亦高于切除殘跡組，表明保留殘跡ACL重建移植物加速韌帶化與局部血管、神經(jīng)等相關(guān)生長因子的優(yōu)勢表達(dá)有關(guān)。

本研究存在以下缺陷與不足：（1）本研究對象為兔，其膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)及力學(xué)特點(diǎn)與人類有差異。（2）本研究著重觀察了術(shù)后12周內(nèi)關(guān)節(jié)內(nèi)移植物愈合過程的大體形態(tài)與組織學(xué)，未觀察移植物與骨隧道的腱－骨愈合。（3）對膝關(guān)節(jié)功能評分和移植物組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)不夠精細(xì)。盡管如此，本研究還是提供了保留殘跡對ACL重建移植物韌帶化影響的有益信息。

4 總結(jié)

本研究結(jié)果證實(shí)保留殘跡可加快關(guān)節(jié)內(nèi)ACL重建移植物的再血管化和修復(fù)愈合過程，促進(jìn)移植物的“韌帶化”，為臨床保留殘跡ACL重建提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。這提示ACL重建也應(yīng)像骨折復(fù)位內(nèi)固定一樣遵循生物學(xué)原則，要特別注意保護(hù)局部原有殘跡的血供與神經(jīng)支配。

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