楊蓉娟，許艷蕾，劉雪芹，魏麗莉

（河北省石家莊市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北石家莊 050011）

hTERT反義寡核苷酸對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的影響

楊蓉娟，許艷蕾，劉雪芹，魏麗莉

（河北省石家莊市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北石家莊 050011）

目的探討人端粒酶催化亞基（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）反義寡核苷酸對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的影響。方法反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染ishikawa細胞系，采用TRAP-ELISA法檢測轉(zhuǎn)染后細胞端粒酶的活性，觀察其前后的變化。MTT法檢測細胞活性，流式細胞儀觀察細胞周期及細胞凋亡率變化。結(jié)果轉(zhuǎn)染細胞的端粒酶活性及細胞生長都明顯受到抑制。流式細胞儀檢測到細胞凋亡峰，細胞阻滯于使細胞停滯在G0～G1期，并誘導細胞凋亡，正義寡核苷酸則無此作用。結(jié)論端粒酶hTERT為靶點的反義寡核苷酸可明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖，且具有促凋亡作用。

端粒，末端轉(zhuǎn)移酶；寡核糖核酸類，反義；細胞凋亡

子宮內(nèi)膜癌是婦科常見的三大惡性腫瘤之一，是危害女性健康的常見惡性腫瘤之一，由于激素替代治療的廣泛應用，發(fā)病率逐年上升，長期雌激素對子宮內(nèi)膜的持續(xù)作用是引起子宮內(nèi)膜癌的主要危險因素，同時多基因遺傳也參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病。近來端粒-端粒酶機制成為腫瘤研究的新熱點，端粒酶通過催化端粒合成，保持端粒長度而維持細胞分裂能力，其活性與細胞增殖衰老及腫瘤分化、浸潤、轉(zhuǎn)移能力密切相關［1］。人端粒酶催化亞基（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）基因是決定端粒酶活性最重要的催化亞基。有研究［2］表明，95%子宮內(nèi)膜癌組織的端粒酶陽性，內(nèi)膜癌的形成可能和端粒酶的異常激活有關。所謂反義核酸技術是一種根據(jù)堿基互補原則，用人工合成或生物合成的與特定的基因互補的DNA或RNA片段（或其化學修飾物）阻斷從基因到蛋白的信息流，從而達到抑制或阻斷基因表達的技術。反義寡核苷酸是一類人工合成或構建的重組載體表達的寡核苷酸片段，通過堿基互補的原理，干擾基因的解旋、復制、轉(zhuǎn)錄、mRNA的剪接、加工、翻譯等各個環(huán)節(jié)，從而調(diào)節(jié)細胞的生長、分化等。我們采用針對hTERT基因的反義寡核苷酸（antisense oligodexynucleotides，ASODN）轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌細胞株ishikawa，觀察其對細胞的生長抑制作用及其機制，探討子宮內(nèi)膜癌基因治療的新方法。

1 材料與方法

1.1 hTERT反義寡核苷酸的設計合成：從基因庫中查出hTERT反義寡核苷酸的堿基序列，設計出互補于起始密碼子區(qū)的反義片段，選擇起始密碼子上游6個堿基及后續(xù)的14個堿基，共20個堿基長度為作用的靶序列的ASODN另外合成一段hTERT基因的正義寡核苷酸（sense oligodexynucleotides，SODN）作為對照，每一條鏈均進行全硫代修飾。由北京賽百盛基因技術有限公司合成，寡核苷酸貯藏于-20℃冰箱中備用，使用時用雙蒸水溶解稀釋成所需濃度。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：子宮內(nèi)膜癌細胞株購于北京醫(yī)科大學第一醫(yī)院實驗室，于10%新生牛血清（56℃滅活30min）、100U/mL青霉素、100U/m L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長，0.25%胰酶消化，每周傳代2～3次，實驗所用細胞保持在對數(shù)生長，分為反義寡核酸組、正義寡核酸組、空白對照組。分別加入含10%新生牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液并加入不同濃度的寡核苷酸，終濃度分別為2.5、5、10μmol/L，每孔設3個復孔?？瞻讓φ战M加入等量的培養(yǎng)液。24h更換相應濃度的寡核苷酸1次。

1.3 端粒酶活性的測定：端粒酶活性的檢測用PCR-ELISA方法。按照試劑盒說明書進行操作。取反應管，實驗分空白組、反義寡核酸組5μmol/L、正義寡核酸組5μmol/L，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72h后按以上方法處理細胞，取TRAP反應模板，各加入45μL反應混合物，加入2μL已處理的標本，混勻，加入30μL液體石蠟，置25℃水浴保溫30min，在PCR儀上循環(huán)，94℃120s，94℃30s，48℃30s，72℃90s，72℃300s循環(huán)35次，循環(huán)結(jié)束后，在微孔中加入雜交反應液，再加入擴增產(chǎn)物25μL混勻，設立陰陽及空白對照，置37℃恒溫反應60min。然后加入顯色劑A、B。37℃避光顯色10min，加入終止液，終止反應。在波長450nm讀取OD值。

1.4 凋亡細胞和細胞周期的檢測：采用碘化丙啶（propidumiodide，PI）一步插入法DNA定量熒光染色法，染液中含PI 50ng/m L。上機檢測前去除樣本中70%乙醇，調(diào)整每份樣品的細胞數(shù)為1×106/mL，每樣品中加入DNA染液1mL，在40C冰箱中染色30min，以300目篩網(wǎng)過濾成單細胞懸液。應用FACS-420型流式細胞儀分析細胞凋亡率和細胞周期，每份樣本檢測1萬個細胞，每組共檢測3個樣本，重復3遍。DNA細胞周期則通過B.D公司提供的相應流式細胞分析軟件，計算出細胞周期各時相分布百分比，依據(jù)細胞時相分布計算出細胞增殖指數(shù)，其公式為，PI=［（S+G2M）/（G0+S+G2M）］× 100%。

1.5 細胞增殖抑制實驗：實驗分為反義組、正義組、空白對照組。分別加入含10%新生牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液并加入不同濃度的寡核苷酸，終濃度分別為5、10、15μmol/L，每孔設3個復孔?？瞻讓φ战M加入等量培養(yǎng)液。24h更換相應濃度的寡核苷酸1次。分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72h，在培養(yǎng)皿中按培養(yǎng)液量的10%加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h吸盡培養(yǎng)液，加入與培養(yǎng)液相同量的DMSO，然后振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。立即于自動酶標儀492nm波長測定各孔A值。

1.6 統(tǒng)計學方法：應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 hTERT反義核苷酸對子宮內(nèi)膜癌ishikawa細胞的增殖影響：采用MTT法測定細胞增殖抑制率可知反義核苷酸組細胞生長明顯出現(xiàn)抑制，與反義核苷酸作用的濃度和時間呈依賴性。2.5μmol/L反義寡核苷酸作用于細胞24h其細胞增殖抑制率為19.11%，與正義組細胞增殖抑制率6.41%相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。隨作用時間延長抑制率增加，作用72h其抑制率為42.70%。隨作用濃度的增加其抑制率增加，10μmol/L反義寡核苷酸作用于細胞72h其增殖抑制率為68.80%，最為顯著，與相同濃度的正義組細胞增殖抑制率11.40%相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。不同濃度反義寡核苷酸作用于相同時間，反義組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示hTERT反義核苷酸對子宮內(nèi)膜癌ishikawa細胞的生長有明顯抑制作用。見表1。

表1 hTERT反義寡核苷酸對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖抑制率比較

2.2 ASODN對子宮內(nèi)膜癌ishikawa細胞端粒酶活性的影響：ASODN對子宮內(nèi)膜癌ishikawa細胞端粒酶活性的抑制作用隨著作用時間的延長而增強。在72 h端粒酶活性由0.855±0.025降至0.247± 0.01，抑制作用顯著（P＜0.01）。而空白組及正義寡核苷酸組則無明顯抑制作用。

2.3 流式細胞儀檢測：hTERT反義核苷酸對子宮內(nèi)膜癌ishikawa細胞凋亡和細胞周期的影響：用流式細胞儀檢測到不同濃度的反義核苷酸作用于子宮內(nèi)膜癌細胞48h后出現(xiàn)了一群亞G1期細胞即凋亡細胞，隨反義核苷酸作用濃度的增加細胞凋亡率越來越高。2.5～10μmol/L不同濃度反義核苷酸細胞凋亡率分別為12.46、18.24、26.65，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在同一濃度條件下反義組與正義組及空白組細胞凋亡率相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而正義組與空白組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。進一步用流式細胞儀分析細胞周期發(fā)現(xiàn)hTERT反義核苷酸對細胞周期有明顯影響，與正義組和空白組相比，反義組細胞G0～G1期細胞增多，S期細胞和G2～M期細胞減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。并呈濃度依賴性。增殖指數(shù)在同一作用濃度，反義組與正義組和空白組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），不同作用濃度，反義組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而正義寡核酸組與空白對照組相比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。說明hTERT反義核苷酸明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細胞ishikawa增殖，與細胞增殖抑制實驗結(jié)果相符合。見表2，3。

表2 hTERT反義核苷酸對子宮內(nèi)膜癌ishikawa細胞周期的影響

表3 hTERT反義寡核苷酸作用于細胞48h細胞凋亡率比較

3 討 論

反義核酸技術是用人工合成的或生物合成的特定互補的DNA或RNA片段阻斷從基因到蛋白的信息流，以達到抑制或阻斷基因表達的生物新技術。20世紀80年代早期人們發(fā)現(xiàn)細菌內(nèi)的一類基因組DNA自發(fā)轉(zhuǎn)錄的反義RNA，通過堿基互補原理與靶RNA（主要是mRNA）配對結(jié)合抑制靶RNA的功能，從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平調(diào)節(jié)相關基因的表達，發(fā)揮其生物學作用。隨著研究的深入，反義核酸技術迅速地發(fā)展起來，反義寡核苷酸其優(yōu)點在于高度靶特異性（堿基互補）、設計多樣、合成容易及高度的局部性和針對性，是常規(guī)藥物的設計、生產(chǎn)、作用所不能比擬的。

端粒酶由蛋白催化亞基和指導端粒合成的RNA模板組成，即為具有逆轉(zhuǎn)錄酶特性的核蛋白酶［1］。端粒酶的主要組分為：①端粒酶催化亞單位。②RNA分子或端粒酶RNA，它包含了添加端粒酶重復結(jié)構的模板區(qū)。人類hTR已被克隆。③大量的端粒酶相關蛋白。hTERT是一個最近才被克隆出來的單拷貝基因，其基因組含有逆轉(zhuǎn)錄酶催化區(qū)域高度保守的特異序列。端粒是真核線形染色體末端結(jié)構，由端粒DNA和端粒結(jié)合蛋白組成。它由一端高度保守的重復序列（TTAGGG）n組成，方向5′—3′，長度5～15kb［2］，端粒長度的維持需要端粒酶的激活。自身攜帶模板是端粒酶區(qū)別于一般的純蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶的主要特征之一。國外學者［3］對乳腺癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、食管癌等進行廣泛深入研究。實驗說明hTERT基因反義寡核苷酸能以序列特異性方式抑制hTERT的表達，從而抑制端粒酶的活性，也說明了hTERT與端粒酶活性密切相關，hTERT可能是反義核酸治療的另一個非常好的靶基因。hTERT基因的mRNA全部序列，根據(jù)hTERT基因mRNA的序列分析，設計出互補于起始密碼子區(qū)的反義片段，選擇起始密碼子上游6個堿基及后續(xù)的14個堿基，共20個堿基長度為作用的靶序列。hTERT ASODN的序列為5′-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3′；另外合成一段hTERT基因的正義寡核苷酸（sense phosphorothioate oligodeoxynucleotide，SODN）序列作為對照，正義鏈序列為5′-CCCGCGATGCCGCGCGCTCC-3′，均經(jīng)計算機網(wǎng)上檢索證實與hTERT基因以外的已知人類基因無同源性。每一條鏈均對其進行全硫代修飾。本實驗結(jié)果顯示，通過MTT發(fā)現(xiàn)2.5μmol/L反義核苷酸作用于96孔板，每孔細胞濃度1×104/mL后24h后細胞生長受到抑制，抑制率為其抑制作用并隨作用時間和作用濃度的增加而加強；10μmol/L作用72h時抑制率為抑制效果最強，與正義組與空白組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而正義組與空白組相比差異無統(tǒng)計學意義，細胞生長不受影響。說明hTERT反義寡核苷酸能抑制子宮內(nèi)膜癌ishikawa細胞的生長。一些學者［4］認為，端粒酶抑制劑對細胞的增殖抑制可能與誘導凋亡有關。端粒酶活性被抑制導致一些已經(jīng)處于極短的端粒不能維持功能，細胞染色體發(fā)生斷裂、融合、DNA破壞，觸發(fā)細胞凋亡［5］。研究凋亡最敏感的方法是流式細胞儀檢測。用FCM檢測細胞凋亡率與細胞周期發(fā)現(xiàn)反義核苷酸作用于內(nèi)膜癌細胞48h后可測到凋亡峰，細胞凋亡時形成的DNA堿基片段于G1期前形成的亞峰，即凋亡峰。而正義組與空白組未見明顯的凋亡峰。細胞周期是細胞生長、分裂時，依次經(jīng)過G1、S、G2、M期，一分為二，周而復始的過程，稱之為細胞分裂周期。FCM結(jié)果表明反義組細胞G0～G1期細胞增多，S期和G2～M期細胞減少，增殖指數(shù)也隨之減少，并呈濃度依賴性。與正義組和空白組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。正義組和空白組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。研究［6］發(fā)現(xiàn)，端粒酶活性是細胞周期依賴性調(diào)控。端粒酶在DNA復制期激活，以保持端粒延長，因此，在細胞周期中，端粒酶活性經(jīng)G1～S期逐漸升高，S期最高，G2～M最低，G0～G1期幾乎處于靜止期。實驗證明hTERT反義寡核苷酸在細胞進入DNA合成期前引起DNA損傷，使細胞停滯在G0～G1期，并誘導細胞凋亡［7］。

自從1992年美國食品與藥品管理局首次批準反義藥物用于臨床治療以來，反義技術成為研究的熱點。大多數(shù)惡性腫瘤細胞依靠端粒酶維持不斷復制增生，端粒酶抑制劑有可能成為腫瘤治療的新策略。反義技術應用于臨床有明顯的優(yōu)勢，反義寡核苷酸針對性強，特異性高，幾乎可以完全阻斷靶基因的翻譯，具有良好的抑制效果。端粒酶應用于臨床仍有許多問題有待解決。但是人們依然相信在將來腫瘤治療策略的研究中，端粒酶將起著十分重要的作用。

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（本文編輯：劉斯靜）

R737.33

B

1007-3205（2012）07-0832-04

2012-04-17；

2012-05-20

楊蓉娟（1977-），女，河南林州人，河北省石家莊市第四醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事婦產(chǎn)科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.07.033