閻雙緩，曹志宸

（1.河北省石家莊市第五醫(yī)院感染五科，河北，石家莊050021；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病科，河北，石家莊050051）

干擾素治療前后慢性乙型肝炎患者外周血單核細胞Toll樣受體4的變化

閻雙緩1，曹志宸2

（1.河北省石家莊市第五醫(yī)院感染五科，河北，石家莊050021；2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病科，河北，石家莊050051）

目的探討慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者干擾素治療前后外周血單核細胞To11樣受體4（To11-1ike receptor4，TLR4）的變化及其意義。方法用流式細胞儀檢測30例健康人、65例CHB患者外周血單核細胞表面TLR4的表達，酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測上述患者血清白細胞介素-6（inter1eukin-6，IL-6）的水平。結(jié)果CHB患者組與健康對照組比較，外周血單核細胞TLR4表達水平及血清IL-6水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）?；颊邞?yīng)用干擾素治療12周時TLR4水平及IL-6水平均下降，但與治療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療24周時，患者TLR4水平及IL-6水平均明顯下降，與治療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論TLR4可能與CHB發(fā)病有關(guān)，干擾素抗病毒治療可降低外周血單核細胞TLR4水平。

肝炎，乙型，慢性；單核細胞；白細胞介素6

To11樣受體（To11-1ike receptors，TLRs）是連接天然免疫及獲得性免疫系統(tǒng)的重要橋梁［1-2］，To11樣受體4（To11-1ike receptor 4，TLR4）主要表達在巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞及內(nèi)皮細胞上，它識別病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated mo1ecu1ar patterns，PAMPs）而引起機體特異性免疫反應(yīng)。本研究以慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，

CHB）患者為對象，觀察其干擾素治療前后外周血單核細胞表面TLR4受體表達水平，探討TLR4在CHB中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2010年2月—2011年2月石家莊市第五醫(yī)院住院CHB患者65例，男性42例，女性23例，年齡35～76歲，平均（51.5±15.2）歲。診斷符合2000年西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。e抗原陽性患者丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶≥2倍正常值上限，乙型肝炎DNA＞104U/mL，e抗原陰性患者丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶≥2倍正常值上限，乙型肝炎DNA＞103U/mL，排除其他甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎或人免疫缺陷病毒的合并感染及肝硬化、肝癌等失代償肝病患者，近3個月未用過抗病毒藥物及糖皮質(zhì)激素等影響免疫功能的藥物。健康對照組30例，男性18例，女性12例，年齡22～66歲，平均（31.5±11.3）歲。

1.2 治療方案：所有CHB患者給予干擾素α-2b 針500萬U隔日1次（北京凱因益生，批號S20030032），治療12、24周時檢測外周血單核細胞TLR4水平及血清IL-6水平。

1.3 檢測方法

1.3.1 流式細胞儀檢測外周血單核細胞TLR4：清晨抽取靜脈血2mL，用0.2%乙二胺四乙酸抗凝，4h內(nèi)檢測。取乙二胺四乙酸抗凝血細胞懸液100μL，分別加入APC-anti-CD14單抗10μL和PE-anti-TLR4單抗10μL，室溫放置30min，加入紅細胞裂解液2mL，避光靜置15min，離心，1 000μL磷酸鹽緩沖液振蕩洗滌2次，不加抗體設(shè)置陰性對照。離心棄去保存液，所得細胞以磷酸鹽緩沖液調(diào)整濃度至2×109/L，將標(biāo)本置于流式細胞儀上，以APC-anti-CD14陽性設(shè)門，共獲取門內(nèi)10 000個單核細胞。經(jīng)Ce11quest統(tǒng)計軟件分析，獲取直方圖，以平均免疫熒光強度（mean f1uo-rescence intensity，MFI）表示TLR4的表達強度。

1.3.2 血清白細胞介素-6（inter1eukin-6，IL-6）水平檢測：清晨采集靜脈血5mL，常規(guī)離心后取上清液，-80℃冰箱保存，待測。酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒為晶美生物有限公司分裝的美國Genzyme公司產(chǎn)品。

1.3.3 血HBV-DNA檢測：采用PCR結(jié)合熒光探針的體外DNA擴增和檢測技術(shù)定量檢測DNA含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SAS6.12統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以±s表示，組間兩兩比較采用q檢驗及線性相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外周血單核細胞TLR4水平及血清IL-6水平的表達：CHB患者組治療前與正常對照組比較，外周血單核細胞TLR4表達水平及血清IL-6水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。與治療前比較，患者應(yīng)用干擾素針治療12周時TLR4水平及IL-6水平均下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療24周時，患者TLR4水平及IL-6水平均明顯下降，與治療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。CHB患者經(jīng)干擾素針治療后HBV-DNA呈下降趨勢（P＜0.05），見表1，2。

2.2 外周血單核細胞TLR4的表達與血清IL-6水平的關(guān)系：CHB患者組外周血單核細胞TLR4表達水平與血清IL-6表達水平呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)（r=0.768，P＜0.05）。

表1 CHB患者外周血單核細胞TLR4與血清IL-6水平（±s）

表1 CHB患者外周血單核細胞TLR4與血清IL-6水平（±s）

*P＜0.05 #P＜0.01與對照組比較；△P＜0.05 ☆P＜0.01與治療前比較（q檢驗）

組別例數(shù)TLR4 （MFI）IL-6 （ρ/ng·L-1）健康對照組303.2±2.115.6±5.6 CHB患者組治療前657.5±3.6*94.5±52.2#CHB患者組治療12周656.4±8.479.5±36.6 CHB患者組治療24周654.5±3.6△38.4±12.8☆

表2 CHB患者干擾素治療前后HBV-DNA對數(shù)值變化（n=65，±s）

表2 CHB患者干擾素治療前后HBV-DNA對數(shù)值變化（n=65，±s）

*P＜0.05與治療前比較（q檢驗）

檢測時間HBV-DNA（1og U/mL）CHB患者組治療前6.98±1.52 CHB患者組治療12周5.56±1.25 CHB患者組治療24周3.17±2.51*

3 討 論

免疫介導(dǎo)的肝損傷是多種慢性肝病的主要發(fā)病機制，TLRs信號系統(tǒng)在肝細胞損傷中起重要作用。其中TLR4的識別譜較廣，生物學(xué)作用廣泛，它表達于細胞表面，能直接識別病毒蛋白顆粒，不但具有促進細胞因子的合成與釋放，促進免疫細胞成熟、分化和功能化等作用，還在調(diào)節(jié)機體對入侵病原體的免疫應(yīng)答水平及抗病毒方面有不容忽視的作用［4］。Mozer-Lisewska等［5］在HBV感染兒童患者的肝組織中發(fā)現(xiàn)TLR4的表達，而正常肝組織則無表達。提示TLR4在乙型肝炎發(fā)病中的作用是一個值得探討的問題。

本研究結(jié)果顯示，CHB患者外周血單核細胞TLR4水平高于健康人，且外周血單核細胞TLR4表達水平與血清IL-6表達水平呈正相關(guān)。與尉秀清等［6］的研究結(jié)果一致。目前關(guān)于TLR4表達的調(diào)控機制研究還比較少。內(nèi)毒素是TLR4最重要的配體，體內(nèi)內(nèi)毒素等刺激信號以及IL-6高水平的表達可導(dǎo)致外周血單核細胞TLR4高水平的表達［6-7］。在CHB患者體內(nèi)存在內(nèi)毒素、凋亡細胞等TLR4刺激信號［8-9］，有可能導(dǎo)致外周血單核細胞對上述刺激信號產(chǎn)生過度反應(yīng)，以及單核細胞IL-6高水平表達。IL-6可以通過多種信號通路導(dǎo)致肝細胞的凋亡和壞死，慢性乙型肝炎血清IL-6的水平與病情進展有關(guān)，與肝臟炎癥程度相關(guān)［10-11］。總之，CHB患者外周血單核細胞TLR4表達水平與血清IL-6表達水平可以互相影響，從而在慢性乙型肝炎發(fā)病中發(fā)揮一定作用。

本研究中所有患者均肌內(nèi)注射干擾素抑制HBV。結(jié)果表明，干擾素治療后隨著患者HBVDNA載量下降，外周血單核細胞TLR4水平及血清IL-6水平均為下降趨勢，治療24周時已降至正常水平。干擾素兼具抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的雙重功效，隨著抗病毒療程延長，HBV-DNA載量下降，肝臟炎癥減輕，可能使內(nèi)毒素血癥隨之減輕。內(nèi)毒素等刺激信號減弱，IL-6水平下降，TLR4水平逐漸降低。

綜上所述，外周血單核細胞TLR4表達水平與CHB的發(fā)病及治療轉(zhuǎn)歸有關(guān)。本研究觀察時間尚短，僅為24周，大部分患者仍在堅持治療，我們將繼續(xù)觀察。

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（本文編輯：劉斯靜）

R735.7

B

1007-3205（2012）10-1173-03

2012-02-13；

2012-04-06

石家莊市科技局科技支撐項目（09146763）

閻雙緩（1969-），女，河北石家莊人，河北省石家莊市第五醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事病毒性肝炎基礎(chǔ)及臨床研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.10.023