何丹 任鵬亮 范雪嬌 楊曉龍 李俊葓 劉琳 劉戟△

（1.四川中醫(yī)藥高等?？茖W校藥學與檢驗系，四川 綿陽 621000；2.四川大學華西基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，四川 成都 610041）

食管癌是常見惡性腫瘤，除飲食、環(huán)境因素外，包括乙醇代謝、葉酸代謝、致癌物代謝、DNA修復、細胞周期調(diào)控、癌基因在內(nèi)的許多基因都可能與食管癌的發(fā)生相關(guān)聯(lián)，人類DNA修復機制通過保護基因組免受由內(nèi)外源性因素導致的各種損傷從而保持基因組穩(wěn)定性［1］。單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是人類遺傳變異最普遍的形式，各種證據(jù)表明DNA修復基因特定單核苷酸多態(tài)性位點會影響酶的表達水平、酶活性以及個體對DNA損傷的修復效能，修復基因缺陷可能導致遺傳不穩(wěn)定和癌癥發(fā)生［2－3］，暗示腫瘤發(fā)生風險的個體差異與特定修復基因的多態(tài)性相關(guān)［1］。我們選擇MSH2和MLH1兩個基因作為錯配修復基因的代表，探討其對食管癌發(fā)生的作用。

錯配修復（Mismatch repair gene，MMR）是DNA修復的幾個酶系統(tǒng)之一，對保持遺傳信息的完整性和穩(wěn)定性，避免遺傳突變的產(chǎn)生具有重要作用。MSH2基因突變可引起包括結(jié)直腸癌、遺傳性無息肉病、Muir－Torre綜合征等的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)某些食管癌病人MSH2基因嚴重缺陷，其低水平表達與食管癌發(fā)生相關(guān)［4］，體外實驗證實MSH2基因多態(tài)性可能改變其蛋白功能［5］。MLH1基因突變是以DNA微衛(wèi)星不穩(wěn)定性為標志的大部分散發(fā)性腫瘤的特征之一，并常見于直腸、子宮內(nèi)膜和胃部腫瘤中。此外MLH1基因還參與有絲分裂和減數(shù)分裂的重組事件，與異源雙鏈的校正及細胞凋亡有關(guān)。但MSH2和MLH1基因與食管癌發(fā)生的關(guān)系尤其是其聯(lián)合作用在中國人群中的研究尚少見報道。鑒定這些DNA錯配修復酶突變基因型與食管癌發(fā)生的相關(guān)性可能有助于闡明食管癌的病因?qū)W機制并對該疾病發(fā)生風險進行預測和判斷。因此，我們進行了一項基于醫(yī)院的包括169例食管癌病人和132例對照的研究，探究MSH2c.2063T＞G和MLH1IVS14－19A＞G兩個基因單核苷酸多態(tài)性位點與食管癌發(fā)病風險之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

所有研究對象均為中國人群，包括2005年4月到2011年6月期間在四川省綿陽市腫瘤醫(yī)院招募的169例經(jīng)組織病理學確診的食管癌患者（不受年齡、性別、組織學類型限制，術(shù)前未經(jīng)放射和抗癌藥物治療）和132例無血緣關(guān)系的健康個體作為正常對照（主要來自于體檢者，并按性別和年齡與病例頻數(shù)配對）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的“全血基因組DNA快速提取試劑盒（溶液型）”提取全血基因組DNA。

1.2.2 單核苷酸多態(tài)性位點分析

采用PCR體外擴增目的基因片段和限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)分析（RFLP）方法檢測目的基因多態(tài)性位點的基因型。引物序列設(shè)計及擴增反應(yīng)條件和RFLP所用酶見表1。擴增反應(yīng)在熱循環(huán)儀MyGeneTMSeries Peltier Thermal Cycler上進行。酶切產(chǎn)物經(jīng)8.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴乙錠染色，紫外光照射下在凝膠成像系統(tǒng)上觀察分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。病例組和對照組兩組間的人口特征差異顯著性以χ2檢驗所得P值確定。以非條件Logistic回歸分別計算兩組等位基因及基因型頻率，通過經(jīng)年齡、性別、吸煙、飲酒、癌癥家族史等校正后的比值比（OR）及其95%可信區(qū)間（95%CI）評估各種基因型或者基因之間交互作用與食管癌風險的相關(guān)性。所有的統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗，差異顯著性設(shè)定在P＜0.05。

表1 PCR－RFLP引物序列設(shè)計及擴增反應(yīng)條件和酶切分析結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 人口特征

本研究中共計301個樣本，包括169例食管癌患者和132健康人。表2顯示了所研究人群主要特征。在年齡和性別分布上兩組人群沒有明顯差別（P＞0.05），但是吸煙和飲酒在病例組的比例明顯高于對照組，分別是71.0%，59.8%和30.3%，32.6%，表明吸煙和飲酒是食管癌發(fā)生的危險因素，這與通常的認識相符，然而在癌癥家族史上兩組沒有明顯差別（P＞0.05）。

表2 病例組（169名）和對照組（132名）研究對象的人口特征分布

2.2 單核苷酸多態(tài)性和食管癌發(fā)生風險

表3顯示了MSH2和MLH1基因在食管癌患者組及正常對照組中的等位基因與基因型頻率分布。經(jīng)Hardy－Weinberg遺傳平衡定律檢驗，對照組所有基因型符合遺傳平衡（P＞0.05），具有群體代表性。在病例組中 MSH2TT，TG和GG基因型頻率分布分別為115（68.1%），34（20.1%）和20（11.8%），與對照組差別極大，分別為122（92.4%），10（7.6%）和0。與野生型TT攜帶者相比，突變雜合子TG和純合子GG更易患食管癌（OR＝5.03，95%CI＝1.99－11.08，P＝0.001）。對于MLH1，病例組中AA，AG，GG基因型頻率分布分別為118（69.8%），48（28.4%）和3（1.8%），與對照組也有一定差別，分別為107（81.1%），24（18.2%）和1（0.7%）。其中突變GG等位基因的攜帶者發(fā)生食管癌的風險是AA野生型純合子的2.45倍（OR＝2.45，95%CI＝1.39－47.78，P＝0.030）。

2.3 單核苷酸位點多態(tài)性相互作用和食管癌發(fā)生風險

由于癌癥發(fā)生發(fā)展是一個錯綜復雜的多因素參與的過程，某一通路上的基因可能會與同一通路上的其它基因作用，甚至可能與其它通路上的某些基因有交互作用，共同調(diào)節(jié)癌癥的易感性?；谙惹把芯?，MSH2和MLH1基因在一定程度上均增加了食管癌的發(fā)生風險，我們進一步探究這兩個基因之間的相互作用（見表4），發(fā)現(xiàn)MSH2和MLH1共同作用于食管癌的發(fā)生，且統(tǒng)計學差異性顯著。表4所示僅攜帶一種突變基因型的人發(fā)生食管癌的風險是正常非攜帶者的1.87到2.42倍；攜帶兩種突變基因型的人發(fā)生食管癌的風險大大增加，是正常非攜帶者的14.73倍，這一發(fā)現(xiàn)可能會對食管癌的發(fā)生提供新的線索。

表3 MSH2和MLH1基因型頻率分布及其與食管癌風險的關(guān)系

表4 聯(lián)合分析MSH2和MLH1多態(tài)性與食管癌發(fā)生風險估計

3 討論

細胞DNA容易遭受包括細胞內(nèi)活性物質(zhì)和環(huán)境因素等的一連串打擊造成損傷，通過不同修復通路可將DNA損傷導致的中毒和突變的影響減到最?。?］。研究表明，DNA修復能力降低與癌癥風險增加有關(guān)［1］。許多DNA修復基因具有單核苷酸多態(tài)性，導致氨基酸序列替代的SNP可能改變修復酶的活性，食管癌的發(fā)生發(fā)展，跟所有其他腫瘤一樣，牽涉到包括異常細胞周期調(diào)控、DNA修復障礙，核受體缺陷等多個基因突變［7］。在本研究中，我們分析了DNA修復基因的兩個多態(tài)性位點 MSH2c.2063T＞G以及MLH1IVS14－19A＞G與食管癌易患性的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個位點均使食管癌發(fā)生風險增加。

MSH2作為錯配修復通路上的重要組件，在特定類型的錯誤比如新鏈DNA合成堿基配對的錯配中起修復作用。在第13號外顯子第688位密碼子的MSH2c.2063T＞G單核苷酸多態(tài)性位點位于Walker A基序，這個基序與ATP酶V型結(jié)構(gòu)域的α和β磷酸基團相互作用，是 MSH2修復活性所必須［8］。研究證明，純化的酵母和人MSH2–MSH6復合體中這一基序中的突變導致該蛋白與ATP的結(jié)合和水解能力急劇下降［9］，并且在大腸桿菌和酵母中非保守氨基酸的替換導致錯配修復能力的下降甚至丟失。這在本研究位點 MSH2c.2063T＞G中同樣有可能發(fā)生，隨著非極性疏水性的甲硫氨酸被一個大的帶正電荷的精氨酸替代，此結(jié)構(gòu)域由于引入了一個大的正電荷殘基可能會有結(jié)構(gòu)上的重大改變。在對宿主細胞再活化分析中，第688位Arg等位基因可能會與內(nèi)外源性致癌物導致的損傷修復低能有關(guān)［10］。目前對錯配修復基因MSH2與食管癌關(guān)系的研究主要集中在組織蛋白表達水平。研究顯示，在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在著MSH2基因的改變，其在組織中的表達下調(diào)［11］。另有報道稱該基因啟動子區(qū)DNA甲基化明顯高于正常對照組，且甲基化程度隨疾病進展增加，表明甲基化與MSH2基因蛋白表達缺失相關(guān)，是導致其錯配修復功能缺陷的重要原因之一［4］。MLH1基因突變是以DNA微衛(wèi)星不穩(wěn)定性為標志的大部分散發(fā)性腫瘤的特征之一，此外MLH1基因還參與有絲分裂和減數(shù)分裂時的重組事件，與異源雙鏈的校正及細胞凋亡有關(guān)。以上證據(jù)均不同程度印證了我們的結(jié)果，但仍需大量樣本量和不同種群人口研究來確證。

MSH2和MLH1多態(tài)性聯(lián)合作用對于食管癌發(fā)生風險的統(tǒng)計學意義上的顯著性使我們推測，有這樣的可能性：兩個基因在某些水平相互作用共同維護基因組穩(wěn)定性，它們中的一個或者兩個基因缺陷可能會是食管癌的發(fā)生發(fā)展因素?？傊狙芯勘砻鱉SH2c.2063G和mlH1IVS14－19G等位基因?qū)τ谑彻馨┑陌l(fā)生起到一定作用，并且MSH2和MLH1兩個多態(tài)性之間的交互作用大大增加了食管癌的發(fā)生風險，表明修復基因之間可能存在一定程度的“交流”，即錯配修復基因MSH2和MLH1多態(tài)性間共同作用調(diào)節(jié)各自在食管癌易感性上的致癌效應(yīng)。這一作用果真存在的話，對于食管癌的發(fā)生將是一項新的很有前景的發(fā)現(xiàn)，我們將對此進行更深入地研究，為對食管癌發(fā)生的分子機制進行更全面的理解、提高篩查效率以及食管癌的治療和預防將大有裨益。

1 Hiyama T，Yoshihara M，Tanaka S，et al.Genetic polymorphisms and esophageal cancer risk［J］.Int J Cancer，2007，121（8）：1643－1658.

2 Goode EL，Ulrich CM，Potter JD.Polymorphisms in DNA repair genes and associations with cancer risk［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2002，11（12）：1513－1530.

3 Miller KL，Karagas MR，Kraft P，et al.XPA，haplotypes，and risk of basal and squamous cell carcinoma［J］.Carcinogenesis，2006，27（11）：1670－1675.

4 張功員，馬春曉，劉秋亮，等.食管癌組織中hMSH2基因啟動子區(qū)甲基化檢測［J］.中華腫瘤雜志，2005，27（9）：541－543.

5 Jascur T and Boland CR.Structure and function of the components of the human DNA mismatch repair system［J］.Int J Cancer，2006，119（9）：2030－2035.

6 Wood RD，Mitchell M，Sgouros J，et al.Human DNA repair genes［J］.Science，2001，291（8）：1284－1289.

7 邢德印，齊軍，譚文，等.北京地區(qū)漢族人群DNA修復基因XPD單核苷酸多態(tài)性與肺癌及食管癌風險的研究［J］.中華醫(yī)學遺傳學雜志，2003，20（1）：35－38.

8 Gorbalenya AE，Koonin EV.Superfamily of UvrA－related NTP－binding proteins implication for rational class cation of recombination／repair systems［J］.J Mol Biol，1990，213（4）：583－591.

9 Obmolova G，Ban C，Hsieh P，et al.Crystal structures of mismatch repair protein MutS and its complex with a substrate DNA［J］.Nature，2000，407（7）：703－710.

10 Medina－Arana V，Barrios Y，F(xiàn)ernández－Peralta A，et al.New founding mutation in MSH2associated with hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome on the Island of Tenerife［J］.Cancer Lett，2006，244（2）：268－273.

11 唐郡，閻曉初，彭貴勇，等.食管鱗狀細胞癌癌組織中hMLH1hMSH2的表達及其意義［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2007，7（11）：1687－1689.