劉虹才,鄢洪德,徐 瑋,汪 釗

(浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院,浙江 杭州 310014)

酯水解酶(Ester hydrolase)，是一類極其重要的生物催化劑，可水解酯類物質(zhì)產(chǎn)生相應的酸和醇，在日用化學品、食品、醫(yī)藥、制革、紡織等行業(yè)應用極其廣泛[1]；也可以在有機相中催化可逆的合成反應，如酯化、轉(zhuǎn)酯化、酯交換等，其催化作用具有化學選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性[2,3]。

米曲霉(Aspergillusoryzae)是絲狀真菌中普遍存在的種屬，具有表達多種酶蛋白的能力，如蛋白酶、淀粉酶、酯酶、纖維素酶等，且不產(chǎn)生黃曲霉素等毒性物質(zhì)，是公認為對人體安全的菌株，廣泛應用于食品、飼料、釀酒等發(fā)酵工業(yè)。米曲霉還具有分泌蛋白質(zhì)及產(chǎn)胞外酶的能力，其發(fā)酵性能優(yōu)良，因此又成為具有商業(yè)潛力的基因工程表達系統(tǒng)[4,5]。實驗室篩選到一株產(chǎn)酯水解酶的米曲霉菌株WZ007，是既產(chǎn)胞內(nèi)酶又產(chǎn)胞外酶的典型菌株，其所產(chǎn)的酶在酯化拆分生物素中間體內(nèi)酯和硫辛酸時表現(xiàn)出良好的光學選擇性[6,7]，但酶活力較低，所需反應時間長，不利于工業(yè)化應用。為了提高其產(chǎn)酶活力，采用γ-射線對米曲霉WZ007進行誘變，獲得一株誘變效果較好的突變株米曲霉Cs007。

響應面法(RSM)是一類簡易、迅速、可靠的統(tǒng)計學優(yōu)化方法，在微生物培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件的優(yōu)化工作中發(fā)揮著極其重要的作用[8]。比起傳統(tǒng)的優(yōu)化方法如逐因子實驗和部分因子實驗，響應面法能快速有效地分析各因素的主效應及交互效應，在一定水平范圍內(nèi)求得最佳值。

作者在此利用響應面法結(jié)合單因子實驗來優(yōu)化米曲霉Cs007的發(fā)酵產(chǎn)酶條件，以進一步提高其產(chǎn)酶活力，為其應用創(chuàng)造條件。

1 實驗

1.1 菌種、試劑和培養(yǎng)基

AspergillusoryzaeCs007為實驗室保藏菌種，經(jīng)500Gy137Csγ-射線輻照(劑量為1.3 μSv·h-1)誘變篩選獲得。其原始菌種為AspergillusoryzaeWZ007，由實驗室篩選得到，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC No.M206105)。

對硝基苯酚乙酸酯(pNPA)，Alfa公司；橄欖油、蛋白胨、酵母膏、蔗糖、阿拉伯膠等生化試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

斜面培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度，％)：馬鈴薯 20，蔗糖 2，瓊脂 2，pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度，％)：蛋白胨 1，KH2PO40.15，MgSO40.05，NaCl 0.05，橄欖油1(體積分數(shù))，pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

將米曲霉Cs007在斜面培養(yǎng)基上于30 ℃培養(yǎng)4 d。用無菌水將斜面上的孢子洗下，制成1×106個·mL-1的孢子懸浮液。按10％(體積分數(shù))接種量接至50 mL/250 mL 三角瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r·min-1下培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)液于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清液測定發(fā)酵液酶活力。

1.2.2 酶活測定方法

酯水解酶活力的測定以pNPA為底物，參照Gao等[9]的測定方法并進行改進。將0.1 mL 30 mmol·L-1pNPA的乙腈溶液和2.8 mL 0.05 mol·L-1磷酸緩沖溶液(pH值 7.5)混合后，于40 ℃恒溫水浴保溫5 min；加入適量酶液，反應5 min后立即加入1 mL無水乙醇終止反應，在405 nm下測定吸光度。以滅活的酶液作對照。

酶活力單位定義：每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

1.2.3 實驗設(shè)計

首先通過單因子實驗確定米曲霉Cs007產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的主要組分；再采用SAS 9.0軟件進行Plackett-Burman設(shè)計篩選影響米曲霉Cs007產(chǎn)酶發(fā)酵的顯著因素，然后根據(jù)實驗擬合的一次多項式確定最速上升方向，通過最陡爬坡實驗和Box-Behnken中心組合實驗進行進一步優(yōu)化，實驗結(jié)果用二次多項式回歸擬合，用微分計算預測最佳點，并對擬合方程作顯著性檢驗及方差分析，采用響應面法分析確定顯著因素的最優(yōu)水平；最后通過單因子實驗確定最佳搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)時間。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因子實驗篩選最佳碳源、最佳氮源及最佳表面活性劑

2.1.1 碳源對米曲霉Cs007產(chǎn)酯水解酶的影響

分別以1％的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油、三油酸甘油酯、橄欖油、大豆油、玉米油作為培養(yǎng)基的碳源，考察不同碳源對米曲霉Cs007發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同碳源對產(chǎn)酶的影響

由圖1可看出，培養(yǎng)基中碳源的種類對產(chǎn)酯水解酶的影響很大，以碳水化合物作碳源時，胞外酶活力很低，其中以可溶性淀粉作碳源的酯水解酶活力最低，僅0.04 U·mL-1，由此可見，米曲霉Cs007對碳水化合物的利用能力很弱，可能碳水化合物對該酯水解酶的產(chǎn)生有一定的抑制作用；而以甘油或油脂作碳源時，產(chǎn)酶效果明顯，這與Hoshino等[10]所報道的其它米曲霉菌種利用碳源情況相似，其中橄欖油作碳源的酯水解酶活力最高，達2.8 U·mL-1，因此，選擇橄欖油為發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳碳源。

2.1.2 氮源對米曲霉Cs007產(chǎn)酯水解酶的影響

以1％的橄欖油為培養(yǎng)基的碳源，分別添加1％(質(zhì)量濃度，下同)的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、豆餅粉、玉米粉、硫酸銨、氯化銨為氮源，考察不同氮源對米曲霉Cs007發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同氮源對產(chǎn)酶的影響

由圖2可看出，米曲霉Cs007對氮源的利用有極大的選擇性，無機氮源不利于菌體生長，幾乎不產(chǎn)酶；有機氮源有利于菌體生長，其中以蛋白胨為氮源時，產(chǎn)酶效果最明顯，這與王小花等[11]的研究結(jié)果相似。因此，選擇蛋白胨為發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳氮源。

2.1.3 表面活性劑對米曲霉Cs007產(chǎn)酯水解酶的影響

表面活性劑能提高橄欖油在水中的可溶性，對產(chǎn)酶有著重要的影響。在培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.2％(質(zhì)量濃度，下同)的吐溫-20、吐溫-80、Triton X-100、阿拉伯膠和聚乙烯醇，考察不同表面活性劑對米曲霉Cs007發(fā)酵產(chǎn)酶的影響(以不加表面活性劑的培養(yǎng)基作為對照)，結(jié)果見圖3。

圖3 不同表面活性劑對產(chǎn)酶的影響

由圖3可看出，Triton X-100和阿拉伯膠可明顯促進產(chǎn)酶，其中阿拉伯膠的效果更好。因此，選擇阿拉伯膠為產(chǎn)酶培養(yǎng)基的表面活性劑。

2.2 Plackett-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果分析

根據(jù)單因子的優(yōu)化結(jié)果，通過SAS 9.0軟件進行Plackett-Burman設(shè)計(n=12)：實驗設(shè)計橄欖油(X1)、蛋白胨(X2)、MgSO4(X3)、KH2PO4(X4)、起始pH值(X5)、阿拉伯膠(X6)、溫度(X7)等7個因素，另設(shè)一個虛擬項(X8)，每個因素各取高(+1)、低(-1)兩個水平，響應值Y為發(fā)酵所產(chǎn)酯水解酶酶活。實驗設(shè)計和結(jié)果見表1，各因素水平及效應評價見表2。

表1 Plackett-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果

表2 Plackett-Burman設(shè)計的各因素水平及效應評價(α=0.05，置信度95％)

由表2可知，在7個影響產(chǎn)酶因素中，對產(chǎn)酶的影響顯著且置信度在95％以上的因素為：蛋白胨>KH2PO4>阿拉伯膠>溫度>橄欖油。選擇蛋白胨、KH2PO4和阿拉伯膠這3個因素作為進一步研究對象。其中蛋白胨和阿拉伯膠對產(chǎn)酶呈現(xiàn)正效應，KH2PO4則呈現(xiàn)較大的負效應，要提高產(chǎn)酶能力，應適當提高蛋白胨、阿拉伯膠的濃度，降低KH2PO4的濃度。其它因素根據(jù)其效應的正負，分別固定在較好水平上，即橄欖油和MgSO4的濃度分別為1％、0.05％(質(zhì)量濃度，下同)，起始pH值為5，培養(yǎng)溫度為30 ℃。

2.3 最陡爬坡實驗確定主要因素的水平中心點

根據(jù)Plackett-Burman實驗結(jié)果，對蛋白胨、KH2PO4和阿拉伯膠3個因素進行最陡爬坡實驗。根據(jù)各自效應的大小，設(shè)定蛋白胨(X2)、KH2PO4(X4)和阿拉伯膠(X6)增長的方向和步長依次為+0.1、-0.01、+0.05，最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

表3 最陡爬坡實驗設(shè)計及其結(jié)果

由表3可知，最大產(chǎn)酶區(qū)在4#實驗附近，故以4#實驗的條件為水平中心點，進行響應面實驗設(shè)計。

2.4 響應面法優(yōu)化顯著因子水平

2.4.1 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果

采用Box-Behnken中心組合設(shè)計，以酯水解酶酶活為響應值設(shè)計了3因素3水平共15個實驗點的響應面實驗，其中設(shè)3個零點，零點實驗進行3次，以估計誤差。Box-Behnken實驗的因素和水平見表4，結(jié)果見表5。

表4 Box-Behnken實驗因素與水平

表5 Box-Behnken響應面實驗設(shè)計及結(jié)果

2.4.2 二次回歸擬合及方差分析

根據(jù)表5的實驗結(jié)果，用SAS 9.0進行二次回歸擬合，得到酯水解酶酶活(Y，U·mL-1)與影響產(chǎn)酶的顯著因素(自變量，X)的函數(shù)關(guān)系式為：

Y=6.483333-0.2925X2-0.15875X4-0.16375X6

對回歸分析的結(jié)果進行方差分析，見表6。

表6 方差分析

由表6可知，該方程的各因子與響應值之間的關(guān)系顯著，回歸方程的一次項、平方項都高度顯著，交互項不顯著。在α=0.05水平上，該模型失擬項不顯著，回歸高度顯著。由置信度分析可得該模型決定系數(shù)R2為97.43％，表明97.43％的酶活變化可由該模型分析，回歸擬合度較好。該方程為米曲霉Cs007發(fā)酵產(chǎn)酯水解酶提供了一個合適的模型，因此可用該模型分析和預測米曲霉Cs007發(fā)酵產(chǎn)酶情況。

2.4.3 響應因子水平的優(yōu)化

根據(jù)表5的實驗結(jié)果作三維響應面圖，見圖4。

圖4 酶活與蛋白胨、KH2PO4和阿拉伯膠的響應面圖

由圖4可知，回歸模型存在最大值，該值穩(wěn)定點在(-0.33825，-0.37806，-0.43989)，對應的X2、X4、X6實際取值為1.76、0.11、0.37，Y的最大預測值為6.59，即當?shù)鞍纂恕H2PO4和阿拉伯膠質(zhì)量濃度分別為1.76％、0.11％、0.37％時，該模型預測的最高酶活為6.59 U·mL-1。實際發(fā)酵酶活為6.49 U·mL-1，進一步說明該模型能夠較好地預測實際發(fā)酵情況。

2.5 搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

在上述優(yōu)化的培養(yǎng)條件下(即橄欖油 1％，蛋白胨 1.76％，KH2PO40.11％，MgSO40.05％，NaCl 0.05％，阿拉伯膠 0.37％，起始pH值 5，培養(yǎng)溫度30 ℃)，進一步考察搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響。

2.5.1 搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響

搖床轉(zhuǎn)速主要影響發(fā)酵液的溶氧濃度，米曲霉Cs007是好氧性菌種，在生長和產(chǎn)酶過程中要消耗大量的氧，所以發(fā)酵過程中應不斷振蕩來增加發(fā)酵液的溶氧濃度。培養(yǎng)時間為48 h，考察搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見表7。

表7 搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響

由表7可知，米曲霉Cs007的發(fā)酵過程需氧程度較高，低轉(zhuǎn)速條件下，不能滿足細胞產(chǎn)酶的需求；當搖床轉(zhuǎn)速提高到200 r·min-1時，產(chǎn)酶量最高，達到6.49 U·mL-1；再提高轉(zhuǎn)速，產(chǎn)酶量基本不變。因此，選擇200 r·min-1為最佳的搖床轉(zhuǎn)速。

2.5.2 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

搖床轉(zhuǎn)速為200 r·min-1，考察培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

由圖5可看出，米曲霉Cs007培養(yǎng)24 h后酶活快速上升，48 h時酶活達到最高6.49 U·mL-1，60 h后酶活開始下降。因此，選擇48 h為最佳的培養(yǎng)時間。

3 結(jié)論

利用響應面方法結(jié)合單因子實驗確定米曲霉Cs007菌株最優(yōu)培養(yǎng)條件為：橄欖油 1％(體積分數(shù))，蛋白胨 1.76％(質(zhì)量濃度)，KH2PO40.11％(質(zhì)量濃度)，MgSO40.05％(質(zhì)量濃度)，NaCl 0.05％(質(zhì)量濃度)，阿拉伯膠 0.37％(質(zhì)量濃度)，起始pH值 5，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r·min-1，培養(yǎng)時間48 h。優(yōu)化條件下所產(chǎn)酯水解酶酶活達6.49 U·mL-1，比初始酶活2.8 U·mL-1提高了1.32倍。

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