高 叢,繆錦來,鄭 洲,金 青

(1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042；2．國(guó)家海洋局第一海洋研究所，山東 青島 266061)

纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中，是一種能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶系，通常將其分為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶，可廣泛用于中藥成分提取、食品、紡織、飼料、釀酒、石油勘探等諸多領(lǐng)域，尤其在生物能源工業(yè)中具有重要地位。利用纖維素酶將廢棄纖維類物質(zhì)糖化，用于制備生物乙醇，緩解能源緊張，是解決未來資源問題的一條重要途徑。

目前，人們對(duì)常溫和高溫纖維素酶的研究較多,關(guān)于低溫纖維素酶的研究相對(duì)較少。低溫酶既可以實(shí)現(xiàn)在低溫條件下進(jìn)行高效酶解反應(yīng),同時(shí)也可以通過較低溫度的熱處理使酶失活,從而節(jié)約能量,降低生產(chǎn)成本。因此，對(duì)低溫纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究已成為熱點(diǎn)。

我國(guó)關(guān)于南極低溫纖維素酶的研究才剛剛開始。在南極地區(qū)，科研人員已在冰雪、土壤及巖石樣品中發(fā)現(xiàn)了數(shù)量眾多的微生物，并證明微生物在南極自然環(huán)境下可以產(chǎn)生大量活性物質(zhì)(如低溫酶、抗生素、多糖及脂類等)，為研究低溫纖維素酶提供了豐富資源。

作者在此從82株南極細(xì)菌中篩選出1株高產(chǎn)低溫纖維素酶菌株NJ64，通過16S rDNA序列進(jìn)行鑒定，并對(duì)其產(chǎn)酶條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，以期為南極低溫纖維素酶的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與培養(yǎng)基

南極嗜冷細(xì)菌分離于2001年10月～2002年3月在中國(guó)第十八次南極科學(xué)考察時(shí)采集的南極海水水樣和海冰樣品。

發(fā)酵培養(yǎng)基為2216E液體培養(yǎng)基，配方為：蛋白胨5 g、酵母粉1 g；用過濾陳海水定容至1000 mL，pH值7.0～7.5，121 ℃下濕熱滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基為添加1%羧甲基纖維素鈉的2216E培養(yǎng)基。

1.2 菌株的篩選

采用剛果紅染色法[1]在篩選培養(yǎng)基上對(duì)82株南極細(xì)菌進(jìn)行初步篩選。

1.3 纖維素酶的活性測(cè)定

將菌株于10 ℃搖床培養(yǎng)96 h后，取發(fā)酵液在7000 r·min-1的條件下離心15 min，取上清液，過濾，得粗酶液。

以羧甲基纖維素鈉為底物，采用DNS法測(cè)定纖維素酶活性[2]。在520 nm下用分光光度計(jì)測(cè)定吸收值。以每分鐘每毫升纖維素酶粗酶液水解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生1 μg還原糖所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。

1.4 菌株的鑒定

DNA模板的制備[3]：將50 μL菌體培養(yǎng)液加入到100 μL預(yù)冷的蒸餾水中，在冰上放置1 h以上或者3次凍融循環(huán)(-10 ℃/60 ℃)。

采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物8-27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增[4]。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，1 min；55 ℃，1 min；72 ℃，1.5 min；循環(huán)30次，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后由華大基因上海鼎安生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將所測(cè)定的細(xì)菌的16S rDNA序列同GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比較分析，選取與實(shí)驗(yàn)菌株親緣關(guān)系較近的細(xì)菌用BioEdit軟件的多序列比對(duì)排列(Clustalw multiple alignment)進(jìn)行序列比對(duì)，系統(tǒng)發(fā)育分析采用Mega3.1軟件的鄰接法(Neighbor-joining method)進(jìn)行。

1.5 菌株產(chǎn)酶條件的研究

分別研究培養(yǎng)時(shí)間、初始pH值和培養(yǎng)溫度對(duì)NJ64產(chǎn)酶的影響。將菌株NJ64接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，10 ℃搖床培養(yǎng)120 h，每24 h取發(fā)酵液制備粗酶液測(cè)定纖維素酶活性；將菌株NJ64分別接種于初始pH值為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5及10.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，10 ℃搖床培養(yǎng)96 h，測(cè)定發(fā)酵液中纖維素酶活性；將菌株NJ64接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別于5 ℃、10 ℃、15 ℃及20 ℃搖床培養(yǎng)96 h，測(cè)定發(fā)酵液中纖維素酶活性。

1.6 酶學(xué)性質(zhì)初步研究

取10 ℃搖床培養(yǎng)96 h的發(fā)酵液，離心后得到粗酶液，分別在0 ℃、10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃及60 ℃的條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，40 min后用DNS法測(cè)酶活，確定酶促反應(yīng)最適溫度；將粗酶液分別在pH值為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0及11.0的條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，40 min后用DNS法測(cè)酶活，確定酶促反應(yīng)最適pH值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株篩選結(jié)果

采用剛果紅法從82株南極嗜冷細(xì)菌中初篩到7株產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌。在平板培養(yǎng)基上進(jìn)行剛果紅染色并脫色后，菌落周圍出現(xiàn)明顯透明圈。將此7株菌進(jìn)行復(fù)篩，用DNS法測(cè)定發(fā)酵液的酶活性，比較7株菌產(chǎn)酶活性高低，最終確定菌株NJ64為產(chǎn)酶量最高的細(xì)菌。

2.2 菌株NJ64分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

將南極嗜冷菌NJ64的16S rDNA的PCR克隆子進(jìn)行測(cè)序，獲得長(zhǎng)度為1390 bp的16S rDNA序列，將此16S rDNA序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得的序列注冊(cè)號(hào)為：HQ453988。將此序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。結(jié)果表明，與菌株NJ64同源性較高的菌株均為假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)，其同源性均大于98.5%。16S rDNA序列同源性小于98%，可以認(rèn)為屬于不同的種；同源性小于93%～95%，可以認(rèn)為屬于不同的屬[5，6]。因此，通過16S rDNA序列的比較分析，判斷菌株NJ64應(yīng)屬于假交替單胞菌屬。用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對(duì)，采用Mega3.1軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

圖1 NJ64系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖1可知，系統(tǒng)發(fā)育分析與16S rDNA的序列同源性比較結(jié)果相一致。菌株NJ64屬于交替單胞菌目(Alteromonadales)，交替單胞菌科(Alteromonadaceae)，假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)。

2.3 菌株NJ64產(chǎn)酶條件的研究

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)NJ64產(chǎn)酶的影響(圖2)

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)NJ64產(chǎn)酶的影響

由圖2可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，纖維素酶活性迅速上升，在72 h時(shí)達(dá)到最大值，而后酶活性逐漸下降。因此，確定NJ64產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)時(shí)間為72 h。

2.3.2 初始pH值對(duì)NJ64產(chǎn)酶的影響(圖3)

圖3 初始pH值對(duì)NJ64產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，pH值為7.5時(shí)，纖維素酶的活性最高。因此，確定NJ64產(chǎn)酶的最適初始pH值為7.5。

2.3.3 培養(yǎng)溫度對(duì)NJ64產(chǎn)酶的影響(圖4)

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)NJ64產(chǎn)酶的影響

由圖4可知，培養(yǎng)溫度為5～20 ℃時(shí)，纖維素酶活性變化不大；10～15 ℃范圍內(nèi)的酶活性相對(duì)較高。因此，確定NJ64產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)溫度為10 ℃。

2.4 酶學(xué)性質(zhì)初步研究

2.4.1 酶促反應(yīng)最適溫度

反應(yīng)溫度對(duì)纖維素酶活性的影響如圖5所示。

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)纖維素酶活性的影響

由圖5可知，反應(yīng)溫度為10～40 ℃時(shí)，纖維素酶具有較高的活性，且酶活性隨反應(yīng)溫度的升高變化較為平緩，均保持在較理想水平；反應(yīng)溫度高于40 ℃后，纖維素酶活性急劇下降。因此，可以確定該纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，屬于低溫酶[7]。

2.4.2 酶促反應(yīng)最適pH值

反應(yīng)pH值對(duì)纖維素酶活性的影響如圖6所示。

圖6 反應(yīng)pH值對(duì)纖維素酶活性的影響

由圖6可知，pH值為6.0～9.0時(shí)，隨pH值的增大，纖維素酶活性逐漸升高；pH值大于9.0后，酶活性急劇下降。因此，可以確定該纖維素酶的最適反應(yīng)pH值為9.0左右。

3 結(jié)論

從82株南極嗜冷菌中篩選分離出1株高產(chǎn)低溫纖維素酶的南極細(xì)菌NJ64，經(jīng)16S rDNA鑒定屬于假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonassp.)；其在初始pH值7.5、10 ℃的環(huán)境中發(fā)酵培養(yǎng)72 h時(shí)產(chǎn)酶量最高；所產(chǎn)纖維素酶的最適酶促反應(yīng)pH值為9.0左右、最適反應(yīng)溫度為40 ℃，為典型的低溫纖維素酶。

目前在利用纖維素酶對(duì)廢棄纖維素物質(zhì)進(jìn)行糖化時(shí)，常用的纖維素酶最適酶促反應(yīng)溫度(50 ℃左右)高于酵母的發(fā)酵溫度(37～40 ℃)[8]，而本實(shí)驗(yàn)篩選得到的低溫纖維素酶的酶促反應(yīng)溫度與酵母的發(fā)酵控制溫度范圍較為一致，可以將纖維素糖化與發(fā)酵同步進(jìn)行生產(chǎn)乙醇，具有較好的應(yīng)用前景。

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