陳 成蘆 明李茗初方加勝

U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中腦腫瘤干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

陳 成1蘆 明2李茗初3方加勝4

目的本研究旨在從U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中分離、培養(yǎng)和鑒定腦腫瘤干細(xì)胞，觀察其的生長特征，為腦腫瘤干細(xì)胞的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。方法應(yīng)用簡化的無血清培養(yǎng)基和懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)U251細(xì)胞，并將獲得的腦腫瘤干細(xì)胞接種于含血清培養(yǎng)基中觀察其分化；交替用含血清培基和無血清培基培養(yǎng)U251細(xì)胞，觀察其生長特性；用免疫熒光法檢測腦腫瘤干細(xì)胞中CD133和Nestin的表達(dá)。結(jié)果U251細(xì)胞接種至無血清培養(yǎng)基后，部分細(xì)胞能夠存活并增殖為懸浮生長細(xì)胞球，并具有很強(qiáng)的自我更新和增殖能力；這種懸浮生長的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含血清培基中后可貼壁分化；U251細(xì)胞在含血清培基和無血清培基中交替培養(yǎng)時(shí)能夠快速轉(zhuǎn)換生長方式；腦腫瘤干細(xì)胞中CD133和Nestin表達(dá)陽性。結(jié)論U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中含一定比例腦腫瘤干細(xì)胞，此種細(xì)胞可在體外分離，培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化。腦腫瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)可能將為腦腫瘤研究提供全新的思路。

U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系；腦腫瘤干細(xì)胞；分離培養(yǎng)；分化

Singh和Hemmati等分別報(bào)道了利用含特殊成分的無血清培養(yǎng)基從神經(jīng)上皮來源腦腫瘤中分離出具有神經(jīng)干細(xì)胞（Neural Stem Cell，NSC）性質(zhì)的腫瘤細(xì)胞，并證實(shí)其為腦腫瘤干細(xì)胞（Brain Tumor Stem Cell，BTSC）[1,2]。U251細(xì)胞系（U251 glioma cell line）是一種應(yīng)用廣泛神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞來源的，較成熟的腫瘤模型。本實(shí)驗(yàn)中，我們用簡化的無血清培基懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)U251細(xì)胞，從中分離培養(yǎng)腦腫瘤干細(xì)胞，觀察其形成腦腫瘤干細(xì)胞球（Brain Tumor Sphere，BTS），及腦腫瘤干細(xì)胞的增殖、分化等生長特性，檢測神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物CD133和Nestin在腦腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)，為腦腫瘤干細(xì)胞的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)基U251細(xì)胞系由中南大學(xué)腫瘤研究所惠贈。特級胎牛血清（Hyclone）、DMEN/F12（1:1）培養(yǎng)基（Gibco）、B27添加劑（Gibco）、重組人表皮生長因子（EGF,PeproTech）、重組人堿性成纖維生長因子（bFGF,PeproTech）。配制成10%的含血清培基和含EGF（20ug/L）、bFGF（20ug/L）、2%B27的無血清培基。

1.2檢測試劑小鼠抗人 CD133單克隆抗體（R&D System），小鼠抗人 Nestin單克隆抗體（Chemicon），F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（Boster），Cy3標(biāo)記綿羊抗小鼠IgG（Sigma）。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及傳代將U251細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，用10%的含血清培基貼壁培養(yǎng)，每48小時(shí)按1:3的比例傳代一次，使之大量擴(kuò)增。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用D－Hanks液漂洗兩遍后，0.25%胰酶消化，自制巴斯德吸管機(jī)械吹打成單細(xì)胞懸液，洗去胰酶重懸于無血清培基。臺盼蘭染色并用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整成5×105/孔接種于6孔板，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。增殖形成腫瘤干細(xì)胞球后，將其收集并機(jī)械吹打，在保存細(xì)胞活力的前提下盡量將腫瘤干細(xì)胞球吹散，重懸于無血清培基，按1:2比例傳代于6孔板。

1.4腫瘤干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化取性狀穩(wěn)定的第3、4、5代的腫瘤干細(xì)胞球，反復(fù)吸打成細(xì)胞懸液，用D－Hanks液漂洗兩遍后，直接接種到 10%的含血清培基中，腫瘤干細(xì)胞球完全轉(zhuǎn)變成單層貼壁細(xì)胞并增殖后，按1:3的比例傳代。

1.5 U251細(xì)胞在無血清和含血清培基中交替培養(yǎng)，腫瘤干細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇按1.3所示的方法在無血清培基中培養(yǎng)出典型的腫瘤干細(xì)胞球后，按1.4所示的方法接種到含血清培基并傳代一次后，再按1.3所示方法接種到無血清培基。如此在無血清和含血清培基中交替培養(yǎng)，重復(fù)3次。

取處于對數(shù)生長期的含血清培基貼壁培養(yǎng)的U251細(xì)胞，用以無血清培基配制的含10%DMSO的凍存液保存細(xì)胞于液氮中。一個月后常規(guī)方法復(fù)蘇，無血清培基重懸細(xì)胞，按1.3所示方法懸浮培養(yǎng)。取腫瘤干細(xì)胞球反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液后凍存、復(fù)蘇、再培養(yǎng)，方法及材料同血清培基貼壁培養(yǎng)的U251細(xì)胞。

1.6腫瘤干細(xì)胞球的免疫組化取培養(yǎng)到第5代的腫瘤干細(xì)胞球及其反復(fù)吹打后的細(xì)胞懸液，離心后滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上，靜置待干，4%多聚甲醛固定，正常血清封閉（對Nestin染色尚需在此之前用 0.4%Triton X-100處理標(biāo)本30min），抗CD133或抗Nestin一抗孵育4℃過夜，Cy3或FITC標(biāo)記二抗避光孵育37℃30min，每步驟間均用0.01M PBS沖洗3遍。封片后置熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1腫瘤干細(xì)胞球的形成將U251細(xì)胞接種至無血清培基，2h后倒置相差顯微鏡觀察，大部分細(xì)胞懸浮生長，但仍有部分細(xì)胞貼壁并長出突起，見圖1A。24h后部分孔中可見腫瘤干細(xì)胞球，第三天貼壁細(xì)胞仍較多，貼壁細(xì)胞有不規(guī)則突起，但增殖不明顯；此時(shí)各孔明顯可見腫瘤干細(xì)胞球生成，部分腫瘤干細(xì)胞球表層細(xì)胞長出突起并貼附培養(yǎng)板底壁，見圖1B。本實(shí)驗(yàn)室采用相似方法和培基培養(yǎng)的人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞球沒有這種現(xiàn)象。傳代后腫瘤干細(xì)胞球增殖較迅速，且貼壁細(xì)胞和貼壁的腫瘤干細(xì)胞球均明顯減少，見圖1C。培養(yǎng)到第三代，培養(yǎng)板中幾乎無貼壁細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞球呈典型的球形，邊緣規(guī)則無突起，折光性好，細(xì)胞間連接較緊密，見圖1D。第三代后腫瘤干細(xì)胞球增殖速度，形態(tài)等都較穩(wěn)定。約72h傳代一次，如培養(yǎng)超過5d，腫瘤干細(xì)胞球大多停止生長，折光性下降，并可見腫瘤干細(xì)胞球周圍有絮狀物生成。

圖1 U251細(xì)胞在無血清培基中的生長情況及其與神經(jīng)干細(xì)胞的比較

2.2誘導(dǎo)分化吹打成細(xì)胞懸液的腦腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含血清培基中后表現(xiàn)出很強(qiáng)的貼壁能力，2h內(nèi)絕大部分細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞形態(tài)及增殖性與原始的U251細(xì)胞相似。

腫瘤干細(xì)胞球轉(zhuǎn)移到含血清培基中后，4h內(nèi)可見幾乎所有的腫瘤干細(xì)胞球貼附培養(yǎng)板底壁，見圖2A；隨后腫瘤干細(xì)胞球變扁，培養(yǎng)細(xì)胞從腫瘤干細(xì)胞球中遷移出來，向四周爬行生長，見圖2B。48h內(nèi)絕大部分腫瘤干細(xì)胞球完全轉(zhuǎn)變成單層貼壁細(xì)胞，均較本實(shí)驗(yàn)室相同條件下培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球明顯迅速。

圖2 腦腫瘤干細(xì)胞球在含血清培基中的表現(xiàn)

2.3 U251細(xì)胞的反復(fù)貼壁和懸浮培養(yǎng)及腫瘤干細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇U251細(xì)胞在含血清培基中呈貼壁生長，而在無血清培基中呈懸浮狀態(tài)生長并形成腦腫瘤干細(xì)胞球，且都能在相應(yīng)的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代。更換培養(yǎng)基后U251細(xì)胞的生長方式很快發(fā)生轉(zhuǎn)換，重復(fù)幾次后這種轉(zhuǎn)換能力并不減弱。

貼壁培養(yǎng)的U251細(xì)胞經(jīng)凍存、復(fù)蘇后仍能順利的分離培養(yǎng)腦腫瘤干細(xì)胞，且其生成腦腫瘤干細(xì)胞球的能力未見減弱。腫瘤干細(xì)胞球吹打成的細(xì)胞懸液經(jīng)凍存、復(fù)蘇、再培養(yǎng)后，細(xì)胞成球數(shù)量減少，增殖緩慢。考慮可能與反復(fù)吹打?qū)е录?xì)胞活力下降，及將腦腫瘤干細(xì)胞球吹成單細(xì)胞懸液較困難，而未吹散的殘存腫瘤干細(xì)胞球直接凍存后復(fù)蘇困難，大部分不能存活等因素有關(guān)。

2.4未分化的腦腫瘤干細(xì)胞能表達(dá)CD133和Nestin 本實(shí)驗(yàn)中從 U251細(xì)胞中分離培養(yǎng)的腦腫瘤干細(xì)胞球中的腦腫瘤干細(xì)胞，及吹打后散在的單個未分化腦腫瘤干細(xì)胞均呈CD133和Nestin染色陽性，見圖3。

圖3 腦腫瘤干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD133和Nestin

3 討論

干細(xì)胞（Stem cell,SC）是一類具有自我更新能力并通過自我更新獲得永生化且具有分化潛能的細(xì)胞。人們同時(shí)也注意到，腫瘤無限增殖特性與正常干細(xì)胞相似。那么腫瘤中是否存在某種具有干細(xì)胞相似性質(zhì)的細(xì)胞，是否正是它們在主導(dǎo)著腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)？腫瘤細(xì)胞是否就是源于正常干細(xì)胞的變異？迅速發(fā)展的干細(xì)胞理論能否幫助我們在長期困擾人類的腫瘤起源問題上取得突破？

近年來，研究者在血液和乳腺腫瘤干細(xì)胞的理論和實(shí)驗(yàn)研究方面取得的一些進(jìn)展向我們揭示了實(shí)體腫瘤干細(xì)胞存在的可能性[3-5]。2003年，Singh和Hemmati各自獨(dú)立證明了神經(jīng)上皮來源腦腫瘤中存在干細(xì)胞性質(zhì)的腫瘤細(xì)胞[1-2]。本研究中，我們從U251細(xì)胞中分離出腦腫瘤干細(xì)胞，并連續(xù)傳代，觀察其形成腦腫瘤干細(xì)胞球的能力和分化能力；用免疫熒光法證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物 CD133和Nestin在腦腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)。

腦腫瘤干細(xì)胞是一個較新的概念，其起源并不確切，腦腫瘤干細(xì)胞有自我更新、分化等能力，提示著它們可能來源于正常的神經(jīng)干細(xì)胞。而腦腫瘤干細(xì)胞與正常神經(jīng)干細(xì)胞有著相似的標(biāo)志物，也從一個側(cè)面支持了腫瘤干細(xì)胞來源于正常的干細(xì)胞[1,2,6]。Recht和Seyfried從基因突變的角度也提出NSC有可能是腦腫瘤干細(xì)胞的起源細(xì)胞，并在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤發(fā)生的最初階段起著重要的作用[7,8]。

腦腫瘤干細(xì)胞理論指出腦腫瘤可能由少數(shù)腦腫瘤干細(xì)胞通過不斷的自我更新和增殖、分化而來[1,9]。我們在實(shí)驗(yàn)中觀察到只有少數(shù)的細(xì)胞能在懸浮狀態(tài)下長期存活并生成腦腫瘤干細(xì)胞球，這些細(xì)胞即腦腫瘤干細(xì)胞。這些腦腫瘤干細(xì)胞可持續(xù)傳代，細(xì)胞數(shù)量不斷擴(kuò)增，在一定條件下能分化為單層貼壁細(xì)胞并與原始U251細(xì)胞相似。以上實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象也符合腦腫瘤起源于腦腫瘤干細(xì)胞的觀點(diǎn)。

腦腫瘤干細(xì)胞理論的提出和腦腫瘤干細(xì)胞的分離，培養(yǎng)及鑒定均具有重要意義。首先，腦腫瘤干細(xì)胞理論為腦腫瘤的來源，腦腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等研究提供了全新的思路；其次，腦腫瘤干細(xì)胞可成為腦腫瘤基礎(chǔ)研究的重要材料，進(jìn)而有可能提出新的治療理論，發(fā)現(xiàn)新的治療藥物和方法；最后，由于腦腫瘤干細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞的相似性，可以預(yù)見二者的研究必將相互促進(jìn)，特別是神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)的一些成熟的理論將在腦腫瘤研究領(lǐng)域引發(fā)新的思考。

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Isolation,Culture and Identification of Brain Tumor Stem Cellswithin U251 Glioma Cell Line In Vitro

Chen Cheng Lu Ming Li Mingchu Fang Jiasheng

ObjectiveThis study was to isolate,culture and identificate brain tumor stem cells from U251 Gliome cell line in vitro and observe their growth pattern.To establish a fundation for further reseach of brain tumor stem cell.MethodsU251cells were seeded in serum-free DMEM-F12 medium supplemented with B27,EGF and bFGF in 6-well plates,after U251 brain tumor spheres formed,they were dissociated and passaged in fresh medium periodically.U251 brain tumor spheres and the single cells of them were induced to differentiate in the medium with 10% FBS supplemented.U251cells cultivate in serum-supplemented medium and serum-free medium alternately.At last we performed immunocytochemistry of U251 brain tumor spheres for CD133 and Nestin.ResultsSome U251 glioma cell have the capacity to self-renew,proliferate and generate free-floating neurosphere-like brain tumor spheres in serum-free medium in vitro.U251 glioma spheres and the single cells of them can be induced to differentiate and adherent to the bottom of the culture plates.The growing patterns of U251 glioma cell line can be converted by changing the culture mediums.The brain tumor stem cell are CD133+Nestin+ cells.ConclusionThe U251 glioma cell line contain brain tumor stem cells which can be isolated,proliferated and differentiated in vitro.The research of brain tumor stem cells may provide a new platform for brain tumor study.

U251 glioma cell line; Brain tumor stem cell; Isolation; Cell differentiation

1 深圳市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東深圳 518020

2 杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江杭州 311200

3 北京市宣武醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100053

4 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)外科，湖南長沙 410008