陶 玉 吉志固 劉玉山 陸曉云 周建云 陳亞麗 何 松

在肺癌的臨床診治工作中，我們常常遇到許多患者就診時(shí)的首發(fā)癥狀為胸腔積液或心包積液，這時(shí)的臨床分期已屬ⅢB或Ⅳ期，即肺癌晚期。對(duì)其胸腔積液或心包積液查找惡性腫瘤細(xì)胞并分型診斷，可能成為這部分患者獲得病理學(xué)依據(jù)的唯一方法。目前對(duì)非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cance，NSCLC)的標(biāo)準(zhǔn)化療，主張以ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ等基因檢測(cè)結(jié)果為指導(dǎo)的個(gè)體化治療。我們采用液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)(liquid based cytology test，LCT)，對(duì)71例胸腔積液或心包積液標(biāo)本在作出細(xì)胞學(xué)診斷的同時(shí)進(jìn)行了ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ等基因檢測(cè)，旨在為晚期NSCLC的個(gè)體化治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)將我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集我院2009年2月～2011年12月的胸腔積液或心包積液標(biāo)本，共獲得晚期NSCLC 71例，所有標(biāo)本必須滿足以下條件:①液基細(xì)胞薄片經(jīng)HE染色后由2位資深細(xì)胞學(xué)醫(yī)師共同閱片并一致診斷為NSCLC;②HE染色的液基細(xì)胞片內(nèi)可見(jiàn)較多癌細(xì)胞;③有足夠的剩余標(biāo)本可供免疫細(xì)胞化學(xué)檢查。71例晚期NSCLC中腺癌69例，鱗癌1例，腺鱗癌1例。男性患者40例，女性31例;年齡39～86歲，平均年齡62.3歲。

1.2 設(shè)備及試劑

1.2.1 液基細(xì)胞薄片制作儀器與試劑 程控離心機(jī) Hettich 46，超柏 Auto Cyte PREP液基細(xì)胞薄片自動(dòng)制片機(jī)(美國(guó)Tripath ImaginInc)及隨機(jī)配置的一次性耗材:12 m l離心管、移液Tip頭、細(xì)胞沉降管、玻片、紅色固定液。自配耗材:50 ml離心管、Tris緩沖粉、蘇木精、伊紅、無(wú)水乙醇。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色儀器和試劑 免疫組化全自動(dòng)染色機(jī)(美國(guó) LAB VISION，AUTO STAINER 720)，單克隆一抗 ERCC1(NeoMarker公司，1∶350)、RRM1(ProteintechGroup，1∶500)、β-tubulinⅢ(BioGenex公司，1∶1000);ERCC1免疫染色所用二抗為PV-9000 Anti-Mouse/Rabbit(北京中杉生物技術(shù)有限公司)，RRM1及β-tubulinⅢ免疫染色所用二抗為EnVision Anti-Mouse/Rabbit(Dako公司)。

1.3 方法

1.3.1 胸腔積液/心包積液液基細(xì)胞薄片的制作［1］①將臨床新鮮送檢的漿膜腔積液靜置15 min左右后取底層的液體(＞50 ml時(shí))45 m l入50 ml離心管(為確保可制成多張含足量癌細(xì)胞的優(yōu)質(zhì)液基細(xì)胞薄片，建議臨床多抽取或?qū)⒁鞯男厍环e液全部送檢)。②用程控離心機(jī)程序3離心10 min(離心力為600 g)，對(duì)于含瘤細(xì)胞少的標(biāo)本需多次取樣離心收集細(xì)胞，直至灰白細(xì)胞團(tuán)達(dá)20 ul以上方可(含瘤細(xì)胞過(guò)少且無(wú)法獲取足夠標(biāo)本量者不宜做此實(shí)驗(yàn))，去上清液后加入10 ml紅色固定液(血性標(biāo)本用吸管吸取瘤細(xì)胞層入紅色固定液以去除過(guò)多的紅細(xì)胞)。③將50 ml離心管再置離心機(jī)內(nèi)用程序3離心10 min，去上清液后加入 pH 8.0的10 m l Tris緩沖液，振蕩，經(jīng)紗布過(guò)濾后將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至12 ml離心管內(nèi)。④用離心機(jī)程序4離心5 min，去除上清液后振蕩，將聚集在管底細(xì)胞團(tuán)振散、混勻，并視細(xì)胞團(tuán)的大小加入適量的Tris緩沖液。⑤將盛有細(xì)胞的混懸液的12 ml離心管置于超柏TM Auto Cyte PREP液基細(xì)胞薄片自動(dòng)制片機(jī)上，啟動(dòng)PrepStain系統(tǒng) ，輸入"NONGYN"進(jìn)入非婦科制片系統(tǒng)，按照系統(tǒng)的操作提示輸入?yún)?shù)進(jìn)行液基細(xì)胞薄片程序化常規(guī)制片染色，先制作1張HE片，將余下的液基細(xì)胞混懸液置冷藏室。⑥將經(jīng)HE診斷為NSCLC且含一定量瘤細(xì)胞的液基細(xì)胞混懸液重新放到制片機(jī)上，仍進(jìn)入非婦科制片系統(tǒng)，按照制片要求輸入?yún)?shù)，終止于常規(guī)HE染色前(為保證每例每張供免疫細(xì)胞化學(xué)的液基細(xì)胞片含有一定量瘤細(xì)胞且厚薄均勻適當(dāng)，應(yīng)根據(jù)HE片含瘤細(xì)胞的情況，調(diào)節(jié)好細(xì)胞混懸液的濃度，含瘤細(xì)胞較少的在制片過(guò)程中輔以手工將收集的所有細(xì)胞全部均勻地倒入各細(xì)胞沉降管內(nèi))，將制作好的液基細(xì)胞薄片收集待免疫細(xì)胞化學(xué)。

1.3.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 液基細(xì)胞片入PBS緩沖液30 min后直接入免疫組化全自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。ERCC1采用PV-9000法(一抗孵育60 min，PV-9000-1、PV9000-2分別孵育20 min，DAB顯色6 min)。RRM1、β-tubulinⅢ 采用 En-Vision法(一抗孵育60 min，EnVsion Anti-Mouse/Rabbit二抗孵育30 min，DAB顯色)。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ陽(yáng)性組織作為陽(yáng)性對(duì)照。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)束后，蘇木精復(fù)染、中性樹(shù)膠封固。

1.3.3 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果判斷 ERCC1陽(yáng)性定位于細(xì)胞核，RRM1及β-tubulinⅢ定位于細(xì)胞質(zhì)。參照復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院提出的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，首先將染色強(qiáng)度計(jì)分:0分為無(wú)色;1分為淡黃色;2分為棕黃色;3分為棕褐色。再按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞的百分比計(jì)分:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分;陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比≤10%為1分;11% ～50%為2分;51% ～75%為3分;＞75%為4分。將染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比得分的乘積作為判斷依據(jù):0～3分為"-"，4～6分為"+"，7～9分為"++"，10～12分為"+++"。

2 結(jié)果

2.1 鏡檢

涂膜面積直徑僅為1.3 cm的LCT細(xì)胞薄片，細(xì)胞分布均勻、紅細(xì)胞大多破壞消失 ，涂片背景清晰、異常細(xì)胞清楚可見(jiàn)。細(xì)胞因采用濕固定且及時(shí)，細(xì)胞形態(tài)保存完好;免疫細(xì)胞化學(xué)染色的陽(yáng)性定位準(zhǔn)確可靠;背景干凈，非特異性背景染色無(wú)或較輕，易于判讀診斷。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)表達(dá)結(jié)果

71例NSCLC胸腔積液癌細(xì)胞ERCC1、RRM1和 β-tubulinⅢ蛋白表達(dá)結(jié)果分別為:ERCC1陰性36例(50.7%)，陽(yáng)性35例(49.3%);RRM1 陰性 52 例(73.2%)，陽(yáng)性 19 例(26.8%);β-tubulin Ⅲ陰性 22 例(31.0%)，陽(yáng)性49 例(69.0%)，見(jiàn)表1。

表1 71例NSCLC胸腔積液癌細(xì)胞ERCC1、RRM1和β-tubulinⅢ蛋白表達(dá)結(jié)果(例，%)

3 討論

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中NCSLC約占所有肺癌的80%，且多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，臨床已失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，化療是晚期NSCLC的主要治療手段。然而NSCLC遠(yuǎn)不如小細(xì)胞肺癌對(duì)化療敏感，化療有效率低，患者長(zhǎng)期生存率低。上世紀(jì)90年代以來(lái)，隨著第3代化療藥物吉西他濱(gemcitabine，Gem)、去甲長(zhǎng)春花堿(vinorelbine，NVB)、紫杉醇(paclitaxe，l TXL)和多西紫杉醇(docetaxe，l TXT)等的出現(xiàn)和應(yīng)用，以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)新的聯(lián)合化療方案成為NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)化療方案，但是聯(lián)合化療有效率也只有30% ～40%，5年生存率僅改善5%左右［3］。同一種病理類(lèi)型和分期的NSCLC用相同的方案及劑量化療，在不同個(gè)體上療效存在明顯差異，使得化療只對(duì)部分NSCLC患者有效，而大部分患者除了遭受化療的毒副作用外并未獲益［4］，此現(xiàn)象考慮與腫瘤耐藥有關(guān)。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的大量研究顯示［5～8］，ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ基因表達(dá)水平，分別與順鉑、吉西他濱、紫杉醇類(lèi)/長(zhǎng)春堿類(lèi)耐藥相關(guān)。聯(lián)合檢測(cè)這些標(biāo)記可以初步預(yù)測(cè)該患者對(duì)某種藥物的敏感程度及其預(yù)后，進(jìn)而針對(duì)不同個(gè)體設(shè)計(jì)不同的化療方案，以提高化療療效、減少不敏感藥物給患者帶來(lái)的不良反應(yīng)，節(jié)約醫(yī)療資源。

然而，在國(guó)內(nèi)外研究中所用實(shí)驗(yàn)材料基本上源自手術(shù)切除或活檢的組織學(xué)標(biāo)本，對(duì)于僅表現(xiàn)為癌性胸腔積液的晚期NSCLC已無(wú)法通過(guò)手術(shù)獲取標(biāo)本，因此如何使這部分患者獲得滿意的樣本材料，并進(jìn)行上述耐藥基因檢測(cè)是實(shí)際工作中迫切需要解決的問(wèn)題。通過(guò)胸腔穿刺/心包穿刺直接抽取積液標(biāo)本獲取瘤細(xì)胞容易、快捷、經(jīng)濟(jì)，對(duì)患者創(chuàng)傷小，可重復(fù)性強(qiáng)，但傳統(tǒng)的方法手工涂片制出的細(xì)胞片，厚薄不勻、背景不清、尤其是血性胸腔積液/心包積液瘤細(xì)胞收集較難，背景過(guò)深，難以做出理想的免疫細(xì)胞化學(xué)片，標(biāo)記結(jié)果判讀困難。我們將收集的71例惡性胸腔積液/心包積液用LCT技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞制片，杜絕了傳統(tǒng)手工細(xì)胞涂片的諸多不足。制出的液基細(xì)胞薄片，面積小(直徑僅為1.3 cm)，背景清晰、紅細(xì)胞大多被去除、癌細(xì)胞數(shù)量多、分布均勻，標(biāo)本因及時(shí)采用濕固定法，細(xì)胞形態(tài)及抗原分子保存良好。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記的細(xì)胞片陽(yáng)性定位準(zhǔn)確，背景干凈，非特異性背景染色無(wú)或較輕，易于判讀，其結(jié)果與組織學(xué)切片的免疫組織化學(xué)結(jié)果基本一致。因此我們認(rèn)為對(duì)表現(xiàn)為胸腔積液或心包積液的晚期NSCLC患者可抽取積液，經(jīng)常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查明確診斷后，采用液基細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)檢測(cè)以獲得合格的ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ等免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)需要的標(biāo)本，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)化療藥物敏感性的預(yù)測(cè)，為患者實(shí)施個(gè)體化治療。

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