郭彩霞 梁曉秋 何曉娟

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率居各類腫瘤的首位。胃癌的早期發(fā)現(xiàn)早期治療尤為重要。1985年美國Missouri大學Smith等［1］創(chuàng)立了噬菌體展示技術。本文應用體內噬菌體展示技術，篩選與人胃癌組織特異性結合的短肽，以指導臨床胃癌的早期診斷和靶向治療，提高藥物靶向的特異性，實現(xiàn)治療的針對性和安全性［2］。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株:人胃癌細胞株SGC-7901為本室保存。實驗動物:BALB/C裸小鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。噬菌體肽庫:噬菌體環(huán)7肽文庫試劑盒 (Ph.D.-C7CTm Phage Display Peptide Library Kit);HRP標記的抗噬菌體單克隆抗體鼠抗M13噬菌體抗體為美國Pharmacia公司產品。M13噬菌體單鏈DNA快速提取試劑盒為美國QIAGEN公司產品。

1.2 裸鼠體內噬菌體的篩選

尾靜脈注射噬菌體隨機環(huán)7肽文庫2×1011pfu/只(將其溶于RPMI-1640溶液中)，15 min后10%水合氯醛麻醉(0.03 ml/10 g)，通過心臟灌注溫熱的生理鹽水20 ml至肝臟完全變白，組織稱重后剪碎，加3 ml 0.1%PBST 洗滌組織3 次，3 000 r/min離心10 min，棄去上清。取1 ml大腸桿菌ER2738與組織靜止感染30 min后，加入4 ml LB培養(yǎng)液室溫孵育30 min，取100μl感染后的菌液測滴度，并計算總產出量。將剩余腫瘤組織感染后的菌液3 000 r/min離心10 min，沉淀全部擴增到10 ml LB，220 r/min，37℃振搖4.5 h，擴增與胃癌組織相結合的噬菌體，4℃下離心純化，用于下一輪篩選，共4輪。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附法測定噬菌體單克隆對SGC7901的親和力

按照酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒說明測定噬菌體單克隆對SGC7901的親和力。

1.4 DNA序列的測定

將ELISA鑒定的噬菌體陽性克隆擴增，試劑盒提取陽性克隆的單鏈DNA，測序，并根據所測得的堿基序列比對出氨基酸序列。

1.5 結果判定

免疫組化染色按照試劑盒說明書進行操作，結果判定:陽性表達為細胞質呈棕黃色。

2 結果

2.1 噬菌體肽庫的胃癌裸鼠體內篩選

15只裸鼠致瘤1～2周后，12只長出瘤狀腫塊，成瘤率80%。噬菌體環(huán)七肽文庫尾靜脈注射胃癌腫瘤裸鼠，每一輪篩選前均加入相同滴度的噬菌體(2×1011pfu/ml)，篩選后分別測滴度(pfu/m l)。4輪篩選后，從單位腫瘤組織中回收的噬菌體量為單位肝臟組織的88.8倍、單位腦組織的6.7×104倍、單位心臟組織9.7×104倍，可見，經過4輪篩選，噬菌體在胃癌腫瘤組織中得以富集(表1)。

表1 噬菌體肽庫胃癌裸鼠體內篩選結果(pfu/g)

2.2 免疫組化測定噬菌體的富集

經過4輪篩選，腫瘤組織結合的噬菌體得到了很好地富集，且區(qū)域廣泛，見腫瘤細胞胞質、胞膜呈明顯棕黃色染色，肝組織中極少數細胞呈淺黃色染色，心臟和腦組織中無黃色染色。

2.3 ELISA鑒定重組噬菌體對SGC7901的親和力

噬菌體肽庫經過4輪體內篩選后，隨機挑選13個噬菌體克隆，以噬菌體原庫藍斑作為對照，得出各克隆的OD值，計算各噬菌體克隆對SGC7901的親和力。當P/N(OD克隆/OD隨機對照克隆)＞2.1時，說明此克隆對SGC7901的親和力強。ELISA結果顯示，P/N＞2.1的陽性克隆有12個，P/N＞2.5的陽性克隆有11個，見圖1。

圖1 ELISA檢測第4輪篩選噬菌體克隆與SGC7901的親和力

2.4 測序結果

12個噬菌體陽性單克隆測序均相同，堿基比對(表2)獲得外源性短肽一條，此短肽序列為PPRWMPS，其理論分子量為869.9 Daltons。7個氨基酸中，堿性氨基酸(R)占17.81%;非極性﹑疏水性氨基酸(W，P)占56.19%;極性﹑中性氨基酸(S，M)占25.99%，測序結果見圖2。

圖2 噬菌體克隆的測序波形圖

表2 序列結果讀取表

3 討論

胃癌作為常見的消化道惡性腫瘤發(fā)病率逐漸增高，占全世界死亡率的第二位［3］，其在我國惡性腫瘤中的發(fā)病率和病死率均居首位［4］。目前，胃癌的治療方法主要有手術治療﹑放療和化療。近年來胃癌的分子靶向治療是1種腫瘤細胞過度表達的某些標志性分子作為治療的靶點，選擇性應用阻斷劑，干預該靶點的分子調控、信號轉導通路，從而達到抑制腫瘤生長、發(fā)展的效果［5］。

Newton等應用體內噬菌體展示技術，篩選得到特異性結合前列腺癌噬菌體肽段，并且將篩選的噬菌體熒光標記與小鼠模型體內成像成功［6］。有報道，用津白Ⅱ荷瘤小鼠，體內篩選到乳腺癌特異性結合噬菌體融合肽［7］。陳貽玲等［8］從T7噬菌體文庫中篩選到肺癌早期檢測分子標志群。Yang等［9］應用改良的噬菌體展示技術(FliTrx細菌肽展示系統(tǒng))，篩選得到特異性結合高轉移性前列腺癌PC-3M-1E8細胞的肽段TMTP1(NVVRQ)，且將TMTP1與FITC結合物注射小鼠體內能有效地檢測到轉移灶。腫瘤特異性結合肽iRGD(CRGDK/RGPD/EC)與抗癌化學藥物結合，使藥物有效地作用腫瘤組織，增強抗癌藥物的療效［10］。

實驗中為了去除噬菌體文庫非特異性結合，我們采用心臟灌注并反復洗滌的方法，最大限度地避免了非特異性結合，保證實驗的準確。噬菌體滴度的測定結果顯示，經過四輪體內篩選，于對照組織相比，腫瘤組織回收的噬菌體量顯著增加，說明此噬菌體與胃癌腫瘤組織特異性結合。噬菌體回收量以及組織免疫組化結果顯示，噬菌體在胃癌組織得到了很好的富集，送測的13個噬菌體單克隆中，測序結果表明有12個序列完全一致，即PPRWMPS出現(xiàn)的次數最多，提示此短肽可能對胃癌裸鼠模型的腫瘤組織具有很強的結合力，有望成為胃癌治療的靶點，為我們下一步研究此短肽與藥物的偶聯(lián)以獲得新的胃癌靶向化療藥物做好準備。

［1］ Smith G P.Filamentous fusion phage:novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface〔J〕.Science，1985，228(4705):1315.

［2］ Hortobagyi GN.Opportunities and challenges in the development of targeted therapies〔J〕.Semin Oncol，2004，31(1Suppl 3):21.

［3］ Simona C，Elena G，Virna C，et al.Research activation of HER family members in gastric carcinoma cells mediates resistance to MET inhibition〔J〕.Mol Cancer，2010，121(9):2.

［4］ 楊海平，張才全.胃癌基因治療的研究進展〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2008，16(6):1058.

［5］ 韓淑梅，馬廷行，劉桂芬，等.胃癌的分子靶向治療研究進展〔J〕.山東醫(yī)藥，2006，46(36):83.

［6］ Newton J，Deutscher SL.Phage peptide display〔J〕.Handb Exp Pharmacol，2008，185(2):145.

［7］ 王 瑞，張 霖，張宏愷，等.津白Ⅱ小鼠體內篩選乳腺癌特異性結合噬菌體融合肽〔J〕.天津醫(yī)科大學學報，2008，14(2):138.

［8］ 陳貽玲，馬傳亮，趙晉峰，等.T7噬菌體展示文庫篩選肺癌早期檢測分子標志群〔J〕.實用癌癥雜志，2009，24(3):227.

［9］ Yang W，Luo D，Wang S，et al.TMTP1，a novel tumor-homing peptide specifically targetingmetastasis〔J〕.Clin Cancer Res，2008，14(17):494.

［10］ Sugahara K N，Teesalu T，Karmali PP，et al.Tissue-penetrating delivery of compounds and nanoparticles into tumors〔J〕.Cancer Cell，2009，16(6):510.