摘要：通過幾年的工作感受，我認為傳統(tǒng)食品微生物檢驗生化試驗的操作規(guī)程，雖然法規(guī)性較強，但由于沒有具體的檢驗道理說明，所以對于普通檢驗員而言，多少會有些茫然，為此我覺得有必要根據(jù)所學做一點補充說明。

關(guān)鍵詞：食品微生物檢驗

食品檢驗的特點是：

①法規(guī)性：檢驗方法必須采用國家法定的檢驗方法，檢驗結(jié)果具有法律效力。

②要檢驗的菌少、雜菌含量多。

a需要增加要檢驗的細菌。

b抑制雜菌。

③檢驗的范圍廣。

④檢驗結(jié)果具有數(shù)量界限。

⑤采樣后要求應盡快檢驗，快出結(jié)果，操作要慎重，結(jié)果要準確。

1 生產(chǎn)實驗原理

在各種法規(guī)檢驗方法中很重要的環(huán)節(jié)就是生化試驗，設(shè)計生化試驗的原則就是：在試驗過程中加入某些化學物質(zhì)，使細菌的代謝產(chǎn)物與加入的化學物質(zhì)產(chǎn)生肉眼可見的變化或特征。以下是我對部分生化試驗原理的解釋。

①過氧化氫酶及過氧化物酶試驗原理：有些微生物可以將過氧化氫分解為水和氧氣.

②甲基紅試驗原理：一些細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可被進一步分解為甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸，使培養(yǎng)基的pH值下降到4.5以下，加入甲基紅呈紅色，陽性。

③V-P試驗原理：一些細菌分解葡萄糖為丙酮酸，進一步脫酸產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中的氧氧化成二乙酰（丁二酮），進而與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中所含的精氨酸的胍基發(fā)生反應生成紅色化合物。

④檸檬酸鹽試驗原理：一些微生物可以以銨鹽作為唯一的氮源，以檸檬酸鹽作為唯一的碳源，在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長，分解檸檬酸鹽生成碳酸鹽使培養(yǎng)基變成堿性，酸性指示劑變色。

⑤馬尿酸鹽試驗原理：一些細菌可以水解馬尿酸生成苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸和氯化鐵反應生成苯甲酸鐵沉淀。

⑥硫化氫試驗原理：有些微生物分解含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的亞鐵鹽反應生成硫化亞鐵沉淀，使培養(yǎng)基變黑。

⑦靛基質(zhì)試驗（吲哚試驗）原理：一些細菌可以分解蛋白胨中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)，靛基質(zhì)可與對二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而成紅色。

⑧卵磷脂酶試驗原理：一些細菌產(chǎn)生卵磷脂酶，分解卵磷脂產(chǎn)生甘油脂和水溶性的磷酸膽堿，在菌落周圍形成一個乳白色的沉淀環(huán)或渾濁帶，在周圍有一個透明圈。

⑨脫氫酶試驗原理：微生物有脫氫酶，可使氯化三苯四唑（TTC）還原，由無色變?yōu)榧t色，所以菌落變紅色。

⑩淀粉酶實驗原理：一些細菌可產(chǎn)生淀粉酶將淀粉分解為雙糖或單糖，加入碘，菌落周圍不變色。

⑾明膠液化實驗原理：一些細菌可產(chǎn)生胞外酶，使明膠蛋白分解為氨基酸，從而失去明膠凝固能力。液化為陽性，仍為固態(tài)為陰性。

⑿重點試驗——三糖鐵試驗（TSI）原理：

1.1 成分：牛肉膏、蛋白胨（氮源）

三糖：葡萄糖0.1%、乳糖1%、蔗糖1%。

酚紅指示劑、瓊脂（pH值調(diào)至7.4，培養(yǎng)基擺成高層斜面）。

1.2 接種：

①穿刺接種。

②斜面劃線接種（36℃培養(yǎng)18-24h）。

1.3 觀察結(jié)果：

①分解葡萄糖、乳糖和蔗糖。斜面產(chǎn)酸變?yōu)辄S色（陽性），底層產(chǎn)酸變?yōu)辄S色（陽性）。

②分解乳糖、蔗糖，不分解葡萄糖。斜面、底層都產(chǎn)酸，都變?yōu)辄S色（陽性）。

③分解葡萄糖，不分解乳糖和蔗糖。斜面產(chǎn)堿顯紅色（陰性），底層產(chǎn)酸顯黃色（陽性）。

④分解含硫氨基酸產(chǎn)硫化氫。硫化氫與亞鐵離子生成硫化亞鐵，使培養(yǎng)基變黑。

⑤分解糖類產(chǎn)氣，培養(yǎng)基中有氣泡或裂縫。

2 前沿技術(shù)的應用原理

2.1 酶聯(lián)免疫吸附測定﹙ELISA﹚原理：酶與Ab或Ag與相應的Ag或Ab結(jié)合，事先將待測標本吸附在固相載體表面，標本中的Ag（或Ab）亦吸附在固相載體的表面，加入酶標Ab（或Ag），酶標Ab（或Ag）與相應Ag（或Ab）結(jié)合后不能被緩沖液沖掉。當加入酶相應的底物時，由于酶的催化作用，底物發(fā)生反應可呈現(xiàn)顏色反應，顏色的深淺與酶作用于底物所形成的有色物質(zhì)的量有關(guān)，即與待測標本中相應的Ag（或Ab）的量成正比。

2.1.1 注釋：固相載體：（聚苯乙烯）

①吸附（也稱包被）；Ag或Ab吸附到固相載體的過程，也稱之酶標板的致敏。

②封閉：用牛血清填補固相載體上剩余的位點。

2.1.2 基本方法：

①4℃過夜包被Ab或Ag。

②PBS沖洗三遍，每次3分鐘。

③加入酶標Ab或Ag（37℃濕盒孵育30分鐘）。

④PBS沖洗三遍。

⑤加入OPD和Ｈ2Ｏ2反應15-30分鐘。

⑥用2Ｍ濃硫酸終點反應（酶作用時間越長，顏色越深，濃硫酸使酶失去活性）。

⑦用酶標儀測OD值（吸光值）。

此測定方法簡便易行、靈敏度高，但易出現(xiàn)假陽性（非特異反應）。

2.2 PCR技術(shù)（P-聚合酶 C-鏈 R-反應）

2.2.1 儀器：PCR儀

2.2.2 三個溫度：變性溫度90-95℃

退火溫度40-60℃

反應溫度（合成ＤＮＡ）70-75℃

2.2.3 引抑為一小段寡聚合苷酸，酶為Tag酶。

PCR是擴增DNA，最終與已知菌（即對照）的DBA用電泳方法比較，若相同則是待測菌。