[摘要] 目的 研究胸腺修飾對異種移植免疫排斥反應(yīng)的影響，探討Th2細(xì)胞的作用。 方法 將供體豚鼠（20只）和受體SD大鼠（20只）隨機(jī)分成四組，A組（對照組）；B組（胸腺修飾IT組）；C組（CVF組）；D組（IT加CVF組），每組各10只，5只供體豚鼠，5只受體SD大鼠。觀測指標(biāo)：脾臟GATA-3，CCR3變化。 結(jié)果 脾臟GATA-3的表達(dá)，測得灰度值分別為：A組：80.718±1.650，B組：81.510±1.890，C組：166.160±7.360，D組：115.074±3.090；D組表達(dá)較C組弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。C組的脾臟GATA-3、CCR3免疫組化較D組表達(dá)明顯增強(qiáng)。 結(jié)論 Th2細(xì)胞的增殖通過豚鼠MSCs修飾大鼠胸腺被有效抑制，從而使大鼠IgG類誘生異種抗體的產(chǎn)生也受到抑制。

[關(guān)鍵詞] 胸腺修飾；異種心臟移植；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；免疫耐受

[中圖分類號] R654.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2012）20-

目前臨床上同種心臟移植術(shù)逐漸成為終末期心臟疾病治療的有效方法，臨床治療上很多患者通過此方法被成功救治，但目前同種心臟移植術(shù)的臨床推廣和應(yīng)用范圍比較小，主要因其自身供體較少，臨床供應(yīng)短缺，導(dǎo)致不能在臨床上廣泛推廣心臟移植手術(shù)。異種移植可用其他物種代替人體器官進(jìn)行移植手術(shù)，因動(dòng)物可以為移植提供無盡的來源，當(dāng)前的異種移植術(shù)值得更廣泛研究，提高異種移植的各項(xiàng)技術(shù)，可使心臟移植手術(shù)大大提高臨床的推廣和應(yīng)用。本研究通過大鼠胸腺修飾的思路來進(jìn)行異種間的分析，以了解Th2細(xì)胞的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM培養(yǎng)液，胎牛血清（FBS，美國Gibco公司）；中華眼鏡蛇毒因子（CVF，昆明倍捷公司）；Goat Anti Rat GATA-3（美國abCAM公司）；Goat Anti Rat CCR3（武漢博士德公司）。

1.2 手術(shù)材料

8-0無創(chuàng)傷縫線（上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司）；手術(shù)顯微鏡（YZ 20T-Ⅲ型）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Heraeus.BB 5060）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

供體選擇；20只豚鼠，要求：健康；雄性，體重控制在在400～450 g。受體選擇：20只SD雌性大鼠，要求：健康，雌性，體重控制在250～300 g，均為南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物室提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 全骨髓貼壁篩選法MSCs分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增 三色豚鼠四肢長骨骨髓，取單個(gè)核細(xì)胞層。待細(xì)胞生長達(dá)到80%融合時(shí)傳代。當(dāng)這些傳代細(xì)胞完全融合時(shí)得到的及為BM-MSCs。

1.4.2 胸腺修飾 大鼠胸腺內(nèi)注射0.1 mL MSCs（1×105個(gè)/0.1 mL/次）。用4號針頭緩慢注入，常規(guī)結(jié)扎穿刺點(diǎn)。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)分組 各組各取供、受體各5只，對A組（對照組）的5只豚鼠和5只大鼠做異位異種腹腔心臟移植，不對其受體作任何特殊的預(yù)處理。對B組（即IT組）進(jìn)行豚鼠MSCs胸腺修飾受體大鼠，并在第15天后對豚鼠到受體大鼠進(jìn)行異位異種的腹腔心臟移植。C組（CVF組）在術(shù)前24 h僅對受體接受CVF預(yù)處理，然后行異種異位移植。D組（CVF+IT組）在受體接受供體MSCs胸腺注射及術(shù)前CVF預(yù)處理，再行異種異位移植。

1.4.4 建大鼠腹腔異位心臟移植模型 采用改良的Ono′s術(shù)式，進(jìn)行豚鼠心臟在受體大鼠腹腔內(nèi)異位移植。經(jīng)主動(dòng)脈反復(fù)將供體心臟血液沖洗干凈（肝素生理鹽水），將沖洗干凈的供體心臟置于冰生理鹽水中備用。心臟移植顯微血管吻合采用二定點(diǎn)吻合法。

1.4.5 檢測大鼠脾臟GATA-3表達(dá)水平（Western blot法） 步驟包括：（1）溶液配制；（2）蛋白樣品制備；（3）SDS-PAGE凝膠電泳；（4）Western印跡法；（5）免疫顯色；（6）結(jié)果分析。

1.4.6 脾臟GATA-3、CCR3表達(dá)水平的檢測 用免疫組化法（SP）法對GATA-3、CCR3蛋白進(jìn)行免疫組化染色，按說明書染色步驟進(jìn)行操作，檢測其表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并分析，計(jì)量資料用（ ±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脾臟GATA-3表達(dá)水平的檢測

4組大鼠脾臟GATA-3表達(dá)水平（Western blot法）檢測結(jié)果顯示：A、B、C、D 4組細(xì)胞總蛋白上樣量一致，且β-actin條帶的亮度基本相同。平均灰度值測定結(jié)果：A、B組中大鼠脾臟GATA-3表達(dá)最弱，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。C組中的表達(dá)明顯高于D組，用Quantity One軟件定量分析的結(jié)果和圖4、5中可明顯看出，GATA-3表達(dá)在D組脾臟中的表達(dá)弱于C組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。C、D組分別與A、B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1、表1。