杜靈敏，宣曉毛，付鴻博,2，徐豆，郭晉鳴，杜俊杰，王鵬飛，穆霄鵬，張建成*

1(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷，030801) 2(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，鄉(xiāng)村振興科技研究所，黑龍江 哈爾濱，150000)

近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高和營(yíng)養(yǎng)保健意識(shí)的增強(qiáng)，果實(shí)中天然生物活性的研究和開(kāi)發(fā)已成為國(guó)內(nèi)外食品研究和生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)，如越橘、樹(shù)莓、黑穗醋栗、藍(lán)莓忍冬和沙棘等果實(shí)天然生物活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)和利用受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣發(fā)關(guān)注和青睞[1-3]?；ㄉ站哂幸欢I(yíng)養(yǎng)和藥理作用，具有抗氧化、抗衰老、抗癌、心血管保護(hù)等生物活性，是一種潛在的功能性著色劑[4]。在食品、化妝品、醫(yī)藥領(lǐng)域有巨大應(yīng)用潛力，是替代合成色素的理想材料，其作為一種天然的、無(wú)公害的、綠色環(huán)保型食用色素，安全性能極高，無(wú)毒，物料來(lái)源豐富。

歐李(Cerasushumilis(Bge.) Sok.) 又稱“鈣果”，是我國(guó)特有的薔薇科櫻桃屬多年生小灌木，主要分布于我國(guó)的黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、山西等13個(gè)省區(qū)[5]。歐李果實(shí)顏色鮮艷，富含豐富的花色苷色素，具有紅色、紫色或紫黑等多種類型。歐李‘農(nóng)大4號(hào)’果實(shí)為紅皮紅肉類型，含有豐富的花色苷色素，但作為我國(guó)特有的一種富含花色苷色素的果樹(shù)，對(duì)果實(shí)花色苷色素生物活性研究報(bào)道較少。本文研究了歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷色素的抗氧化性以及對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用，以期為開(kāi)發(fā)利用歐李花色苷色素與后續(xù)功能農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

歐李‘農(nóng)大4號(hào)’：于2017年9月，在山西省太谷縣巨鑫試驗(yàn)基地采摘，作為試驗(yàn)材料。

供試菌種：大腸桿菌(Escherichia.coli)，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院歐李團(tuán)隊(duì)提供；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 試劑

無(wú)水乙醇(分析純)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；NaOH(分析純)，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；乙酸鈉(分析純)，天津市化學(xué)試劑三廠；AB-8大孔樹(shù)脂，滄州寶恩吸附材料科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基，上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；30%H2O2(分析純)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；FeSO4(分析純)，天津市北辰方正試劑廠；水楊酸(分析純)，天津市北辰方正試劑廠。

1.3 儀器

UV-5200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；JJ224BC型電子天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；SB25-12D超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；HC-2518R高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；DH系列電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市通利信達(dá)儀器廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 花色苷含量的測(cè)定

采用pH示差法測(cè)定，參考LEE等[6]的方法稍作修改。取pH=1.0 KCl-HCl緩沖液和pH=4.5乙酸鈉-鹽酸緩沖液各4.5 mL分別加入到0.5 mL的提取液中，搖勻，平衡15 min，在最大吸收波長(zhǎng)520 nm和700 nm下測(cè)定吸光值，計(jì)算公式如式(1)：

(1)

式中：A=(A520nm-A700nm)pH=1.0-(A520nm-A700nm)pH=4.5；MW=449.2 g/mol；摩爾消光系數(shù)ε=26 900 L/(mol·cm)；DF為稀釋倍數(shù)；L為光程(cm)；V為提取液體積(mL)；m為原料質(zhì)量(g)。

1.4.2 歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷提取工藝優(yōu)化

通過(guò)4因素(乙醇濃度，料液比，pH值，超聲時(shí)間)3水平(乙醇濃度：70%、80%、90%；料液比：1∶5, 1∶6, 1∶7；pH值：1、2、3；超聲時(shí)間：10、20、30 min)正交試驗(yàn)確定歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷提取工藝。

1.4.3 歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷的制備

稱取一定量的歐李‘農(nóng)大4號(hào)’果實(shí)，液氮研磨，按照料液比1∶5加入90%酸化乙醇溶液，超聲提取10 min于10 000×g下離心30 min提取2次，合并上清液，得到粗提液，冷凍干燥得到粗制花色苷粉末。粗提液蒸發(fā)濃縮后通過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂吸附至飽和后先用蒸餾水洗至流出液為中性，再用乙醇洗脫，當(dāng)流出液為無(wú)色時(shí)洗脫完成，收集洗脫液。洗脫液在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后經(jīng)冷凍干燥，得到歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷粉末，純制品中花色苷含量為13.03 mg/g花色苷粉末。記錄花色苷粉末質(zhì)量m，根據(jù)公式計(jì)算提取率。計(jì)算公式如式(2)：

(2)

式中：m，花色苷質(zhì)量，g；m0，果實(shí)質(zhì)量，g。

1.4.4 樹(shù)脂的預(yù)處理

將AB-8大孔樹(shù)脂用4%的NaOH溶液浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性；再用4%的HCl浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性；最后用體積分?jǐn)?shù)有95%乙醇浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性，備用(此處中性以流出液的pH來(lái)判斷)[6]。

1.4.5 歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.4.5.1 DPPH·清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法并稍作改動(dòng)[7]。將提取液稀釋適宜倍數(shù)后，取2.8 mL的DPPH·溶液，加入0.2 mL稀釋后的提取液，充分振蕩混合，室溫避光反應(yīng)30 min，與517 nm下測(cè)定吸光度，記做A1，空白為加入0.2 mL的體積分?jǐn)?shù)為90%乙醇溶液，測(cè)定吸光度記做A2，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。按公式(3)計(jì)算DPPH·的清除率。

(3)

1.4.5.2 FRAP還原力測(cè)定

將提取液稀釋至適宜濃度后，取0.1 mL稀釋液，加入4.9 mL FRAP試劑，避光反應(yīng)10 min后在593 nm下測(cè)定吸光值，0.1 mL的體積分?jǐn)?shù)為90%乙醇作為空白對(duì)照，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次[8]。

1.4.5.3 ·OH清除率的測(cè)定

(4)

1.4.6 歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷抑菌性實(shí)驗(yàn)

1.4.6.1 敏感性實(shí)驗(yàn)[10]

采用牛津杯法。將滅菌的培養(yǎng)基倒入平板，凝固后將0.2 mL的菌懸液均勻涂布于培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻放入3個(gè)牛津杯，其中2個(gè)牛津杯中加0.1 mL一定濃度的歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷純化液；另一個(gè)牛津杯加0.1 mL無(wú)菌水作對(duì)照。置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，通過(guò)抑菌圈判斷抑菌效果。

1.4.6.2 最小抑菌濃度測(cè)定

取歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷粉末，用一定無(wú)菌水稀釋后后，采用二倍稀釋法加入培養(yǎng)基中，然后將稀釋后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種于各培養(yǎng)基中，分別于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)24 h，以出現(xiàn)透明抑菌圈的最低稀釋濃度為最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。

1.4.6.3 高溫處理對(duì)歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷的抑菌效果的影響

根據(jù)MIC配制花色苷溶液，分別于40、60、80、100 ℃下處理30 min，加入到對(duì)應(yīng)的菌液中，以未經(jīng)熱處理(25 ℃)的花色苷溶液作對(duì)照。在0、2、4、6、8、12、20 h取樣，測(cè)OD600值，計(jì)算抑菌率。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算和作圖，采用SAS 8.0和SPSS 20.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷提取條件

采用4因素3水平正交試驗(yàn)(L9(34))，確定最佳提取條件。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

經(jīng)極差分析(見(jiàn)表2)可知，RA>RC>RB>RD，因此，影響提取量大小的因素依次為：A>C>B>D，即乙醇體積分?jǐn)?shù)>pH>料液比>超聲時(shí)間。由圖1正交試驗(yàn)因素水平直觀分析圖可以看出，優(yōu)選方案為A3B1C2D1,即乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，料液比1∶5，pH值2.0，超聲時(shí)間10 min。由于這個(gè)組合在以上9組試驗(yàn)中沒(méi)有出現(xiàn)，因此，進(jìn)一步試驗(yàn)，得到該處理下提取量為24.21 mg/100 g， 高于以上9組試驗(yàn)。因此，確定最終提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%(pH=2.0)，料液比1∶5，超聲時(shí)間為10 min。由表3方差分析可見(jiàn)，因素A、B、C對(duì)花色苷提取量的影響極顯著(P<0.01)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Levels and factors of orthogonal experiment

圖1 正交試驗(yàn)因素水平直觀分析圖Fig.1 Direct observation analysis figure of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance components of orthogonal test

變異來(lái)源(S.V)自由度(df)平方和(SS)均方(MS)FPr>FA2207.432103.716120.558<0.01B233.78016.86019.633<0.01C256.40318.20132.781<0.01D23.2851.6431.909>0.05誤差1815.4850.860總和26316.386

注：P<0.05表示差異達(dá)顯著水平，P<0.01表示差異達(dá)極顯著水平。

2.2 歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷提取

稱取72.00 g歐李‘農(nóng)大4號(hào)’果實(shí)，通過(guò)超聲，冷凍離心，AB-8大孔樹(shù)脂吸附，真空冷凍干燥等工藝，得到深紅色粉末0.48 g，提取率0.67%。

2.3 歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷抗氧化能力

由圖2可知，歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷粗提液DPPH·清除力、FRAP還原力、·OH清除力的TEAC值分別為32.66、24.38、9.59 mg/g花色苷；歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷純化液DPPH·清除力、FRAP還原力、·OH 清除力的TEAC值分別為35.47、33.33、12.01 mg/g花色苷。歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷純化液的DPPH·清除力、FRAP還原力、·OH清除力顯著高于粗提液。

圖2 歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷粗提液與純化液抗氧化能力比較Fig.2 Compare antioxidant activity of anthocyanins the crude product and the refined product from the Chinese dwarf cherry ‘Nongda No 4’注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著。

歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷粗提液DPPH·清除力顯著高于FRAP還原力和·OH清除力；歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷純化液DPPH·清除力顯著高于FRAP還原力和·OH清除力。因此，歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷的抗氧化能力從高到低依次是：DPPH·清除力>FRAP還原力>·OH清除力。

2.4 敏感性試驗(yàn)

由圖3可知，歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷提取液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。

A-大腸桿菌；B-枯草芽孢桿菌；C-金黃色葡萄球菌圖3 歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷抑菌效果Fig.3 Antibacterial effect of anthocyanins from the Chinese dwarf cherry ‘Nongda No 4’

2.5 最小抑菌濃度(MIC)

由表4可知，對(duì)于不同菌種，花色苷對(duì)其抑制效果不一樣。歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別是1 040、520、130 μg/mL。

表4 歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果Table 4 MIC of anthocyanins from the Chinese dwarf cherry ‘Nongda No 4’ on different microorganisms

注:“+”表示有抑菌圈；“-”表示無(wú)抑菌圈。

2.6 高溫處理對(duì)歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷抑菌效果的影響

由圖4～圖6可知，歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌在短時(shí)間內(nèi)抑菌率達(dá)到最高，隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降的趨勢(shì)，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在相同的作用時(shí)間內(nèi)，歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷提取液對(duì)60 ℃以上的高溫較敏感，在高溫下易被破壞，抑菌效果隨溫度的升高而下降。

圖4 高溫處理歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷對(duì)抑制金黃色葡萄球菌的影響Fig.4 Inhibitory effect of temperature on anthocyanins from the Chinese dwarf cherry ‘Nongda No 4’ on Staphlococcus aureus

圖5 高溫處理歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷對(duì)抑制枯草芽孢桿菌的影響Fig.5 Inhibitory effect of temperature on anthocyanins fromthe Chinese dwarf cherry ‘Nongda No 4’ on Bacillus subtilis

圖6 高溫處理歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷對(duì)大腸桿菌抑制率的影響Fig.6 Inhibitory effect of temperature on anthocyanins from the Chinese dwarf cherry ‘Nongda No 4’ on Escherichia.coli

3 討論

歐李花色苷為水溶性色素，在醇溶液和水溶液中溶解性都比較好，本試驗(yàn)選用酸化乙醇溶劑進(jìn)行提取?；ㄉ赵谒峄瘲l件下較為穩(wěn)定，因此，提取過(guò)程通常采用酸化乙醇溶液。酸化乙醇溶液在破壞植物細(xì)胞膜的同時(shí)溶解花色苷，可提高花色苷的提取率[11]。大量花色苷提取方法表明，植物花色苷的提取率受乙醇濃度、pH值、料液比、超聲時(shí)間的影響[12-15]。這與本試驗(yàn)從乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、pH值、超聲時(shí)間4個(gè)方面確定最優(yōu)提取工藝一致。

果實(shí)中的花色苷除作為天然色素外，還具有很強(qiáng)的抗氧化、清除自由基的能力，是一種具有保健功能的天然生理活性物質(zhì)。雷月等[16]研究表明，藍(lán)靛果粗制及精制花色苷具有較強(qiáng)的還原能力、清除DPPH·、·OH的能力，且花色苷的精制品的抗氧化能力明顯強(qiáng)于粗制品。劉敬華等[17]研究表明，藍(lán)靛果高純度花色苷在抗氧化性、穩(wěn)定性方面比精制花色苷更好。張澤生等[18-19]從葡萄皮提取的花青苷能有效清除DPPH·、·OH，尤其對(duì)·OH的清除能力強(qiáng)于抗壞血酸。LINDA等[20]檢測(cè)了12種可食用的果實(shí)，發(fā)現(xiàn)其中9種果實(shí)的半提純成分表現(xiàn)出高的抗氧化性，在半提純部分檢測(cè)到了花青素-3-葡萄糖苷和飛燕草色素-3-葡萄糖苷。本實(shí)驗(yàn)對(duì)歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷粗提液及純化液進(jìn)行DPPH·、·OH、FRAP還原力的測(cè)定，結(jié)果顯示純化液的抗氧化能力性強(qiáng)于粗提液，并且抗氧化能力從高到低依次為DPPH·清除力>FRAP還原力>·OH自由基清除力。

近年來(lái)對(duì)花色苷的抑菌性有很多研究報(bào)道。蔣麗施等[18]對(duì)紫薯花色苷抑菌作用的探究表明，紫薯花色苷對(duì)傷寒沙門(mén)氏菌和福氏志賀氏菌有明顯的抑菌效果且高溫處理會(huì)是紫薯花色苷的抑菌作用減弱。申杰等[21]研究表明楊梅花色苷提取物對(duì)灰莓葡萄孢有抑制作用，且55 ℃處理30 min和90 ℃處理15 min 能使花色苷提取物的抑菌率下降。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷提取液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果的研究，結(jié)果表明，歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷對(duì)以上3種菌有較強(qiáng)的抑制效果。經(jīng)花色苷作用后的Escherichia.coli和Staphylococcusanreusaureus菌體出現(xiàn)質(zhì)壁分離，細(xì)胞質(zhì)稀薄，菌體解體成空泡、菌體細(xì)胞溶解死亡，這表明花色苷能夠影響細(xì)胞壁的通透性[22]。王關(guān)林等[23]對(duì)中藥抑菌研究中曾報(bào)道，皂苷類化合物與蛋白結(jié)合成復(fù)合物的作用，從而影響了細(xì)胞生物膜的通透性。花色苷屬苷類物質(zhì)可能有同樣的作用機(jī)理。歐李‘農(nóng)大4號(hào)’花色苷對(duì)60 ℃以上高溫較敏感，抑菌率隨溫度上升而下降。高溫處理可能破壞了花色苷的功能結(jié)構(gòu)，使其抑菌效果降低。