孫淑琴 李榮華 楊秀榮 田濤

摘要：分別利用草坪草褐斑病菌粗毒素5倍稀釋液和10倍稀釋液接種盆播坪草高羊茅，1周內(nèi)逐天采集處理葉片，測定葉片防御酶(PAL,POD、PPO、CAT)活性變化。結(jié)果表明，坪草高羊茅葉片經(jīng)粗毒素液處理1周內(nèi)，PAL,POD、PPO活性較對照均有不同程度的提高，其總體變化趨勢為先升高后降低，并且高濃度毒素處理較低濃度毒素處理的酶活性高，而經(jīng)毒素處理后的坪草葉片CAT酶活性較對照卻呈現(xiàn)下降的趨勢。

關(guān)鍵詞：草坪草褐斑病菌；粗毒素；防御酶

中圖分類號：S436.8文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942(2012)01-0087-04

由絲核菌屬(Rhizoctonia spp.)病原引起的草坪草褐斑病是世界上報(bào)道最早、分布最廣、危害最重的草坪草病害之一。植株受害部位常為葉片、葉鞘和莖，發(fā)病初期，染病部位呈現(xiàn)梭形、長條形或不規(guī)則形水漬狀病斑，后病斑中心枯白，邊緣變褐，最后葉片干枯萎蔫。受害草坪初期常出現(xiàn)大小不等的近圓形枯草斑，條件適合時(shí)，病情快速蔓延，枯草斑直徑從幾厘米迅速擴(kuò)大到2m左右，嚴(yán)重影響草坪的觀賞價(jià)值和實(shí)用價(jià)值。

目前，有關(guān)草坪草褐斑病的研究大多集中于病害的識別、病原鑒定及防治藥劑的篩選等研究，而對于病原菌與寄主之間互作的研究相對較少。大量研究表明，絲核菌的致病因子——毒素在致病過程中起重要作用，與寄主的致病力存在顯著正相關(guān)，但報(bào)道多見于水稻等大田作物，而有關(guān)草坪草的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。為進(jìn)一步明確草坪草褐斑病病原的致病機(jī)理及病原與寄主的互作關(guān)系，本研究從病原菌代謝產(chǎn)物——毒素出發(fā)，研究不同濃度毒素處理對寄主體內(nèi)防御酶體系的影響，明確寄主應(yīng)對毒素所做出的生理反應(yīng)，以期為病原菌的致病機(jī)理研究提供參考，并為病害的防治提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1供試材料

供試草坪草品種：高羊茅“火鳳凰”。供試菌株：褐斑病病原RH2菌株，經(jīng)鑒定為立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1粗毒素液的制備將RH2菌株在PDA平板中擴(kuò)大培養(yǎng)1周后，用直徑0.5cm打孔器在菌落邊緣打孔，挑取5塊菌盤接種于150ml Ps液體培養(yǎng)基中，25℃靜置培養(yǎng)20d。培養(yǎng)液2層濾紙過濾后，收集培養(yǎng)濾液。

培養(yǎng)濾液加入等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去掉乙酸乙酯，殘留的棕褐色物質(zhì)即為粗毒素。由于乙酸乙酯對草坪葉片有輕微的毒性(經(jīng)試驗(yàn))，所以粗毒素用有機(jī)溶劑甲醇溶解。

1.2.2接種方法盆播苗出苗約1個(gè)月后接種。分別將粗毒素液稀釋成5倍和10倍液作為接種體，甲醇為空白對照。分別將各接種體噴霧接種于葉片上，塑料薄膜保濕24h。試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理，每處理重復(fù)3次。分別于接種后1、2、3、4、5、6d用滅菌剪刀剪下中上部葉片收集，各處理重復(fù)3次的葉片剪碎后混勻，冷凍保藏。

1.2.3酶粗提液的制備過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化氫酶(CAT)提取：取采集葉片0.05g，放入研缽中，加入0.01g PVP，再加入0.05mol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液(pH7.8)1.2ml，分3次加入，冰浴研磨成勻漿，將勻漿全部轉(zhuǎn)入離心管中，4℃ 12000 r/min冷凍離心30min，上清液即為酶粗提取液。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)提?。喝〔杉~片0.05g，放入研缽中，加入0.01g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加入5mmol/L巰基乙醇硼酸緩沖液(pH8.8)1.2ml，分3次加入，冰浴研磨成勻漿，將勻漿全部轉(zhuǎn)入離心管中，4℃ 12000r/min冷凍離心30min，上清液即為酶粗提取液。

1.2.4酶活性測定

(1)PAL活性測定

反應(yīng)體系為：0.1mol/L、pH 8.8的硼酸緩沖液2ml，0.02mol/L的L-苯丙氨酸1ml，酶液0.6ml。將測定管放在30℃恒溫水浴鍋中保溫45min，取出立即加入6mol/L的鹽酸1.0ml終止反應(yīng)，測定290nm處的吸光值?？瞻讓φ找跃彌_液代替酶液，每樣品重復(fù)3次，以每分鐘OD₂₉₀變化0.01為一個(gè)酶活單位。

(2)POD活性測定

反應(yīng)體系為：pH7.8磷酸緩沖液2.9ml，2％過氧化氫(現(xiàn)用現(xiàn)配)1.0ml，0.05mol/L愈創(chuàng)木酚1.0ml，酶液0.08ml，反應(yīng)體系加入酶液后混勻測定OD₄₇₀，每1min讀數(shù)1次，讀3min內(nèi)的變化值，空白對照以緩沖液代替酶液，每樣品重復(fù)3次，以每分鐘OD₄₇₀變化0.01為一個(gè)酶活單位。

(3)PPO活性測定

反應(yīng)體系為：pH 7.8磷酸緩沖液2.0ml，0.1mol/L鄰苯二酚1ml，酶液0.5ml，反應(yīng)體系加入酶液后在37℃恒溫水浴鍋中保溫1h，取出立即加入20％的三氯乙酸2.0ml終止反應(yīng)，紫外分光光度計(jì)測定OD₄₂₀，空白對照以緩沖液代替酶液，每樣品重復(fù)3次，以每分鐘OD₄₂₀變化0.01為一個(gè)酶活單位。

(4)CAT活性測定

反應(yīng)體系為：pH 7.8磷酸緩沖液4.0ml，2％過氧化氫0.16ml，酶液0.4ml，反應(yīng)體系加入酶液后立即開始計(jì)時(shí)，并測定OD₂₄₀，每10s讀數(shù)1次，讀1min內(nèi)的變化值，空白對照以緩沖液代替酶液，每樣品重復(fù)3次，以每分鐘OD₂₄₀變化0.01為一個(gè)酶活單位。

2.結(jié)果與分析

2.1PAL活性變化

如圖1所示(酶活值為3次重復(fù)的平均值，以下均同)，接種毒素1d后，PAL活性顯著升高，5倍、10倍稀釋液處理較對照分別增加33.3％和36.7％。3d后又下降至最低水平。后又迅速升高，5d后達(dá)到最高峰。整體水平來看，接種不同濃度毒素處理的PAL活性變化趨勢基本一致，其中5倍稀釋液處理PAL活性高于10倍稀釋液，且都明顯高于對照。

2.2POD活性變化

如圖2所示，5倍稀釋毒素液接種后，POD活性顯著高于對照，出現(xiàn)先升高后降低2個(gè)高峰。而接種10倍稀釋毒素液處理的POD活性整體呈現(xiàn)下降的趨勢，但5d后又急劇上升。對照處理POD活性在1周內(nèi)變化不大，呈現(xiàn)相對穩(wěn)定的趨勢。

2.3PPO活性變化

由圖3可知，接種處理1d后，5倍、10倍稀釋液處理PPO活性均明顯高于對照，分別高出22.1％和59.2％。1d后，5倍稀釋液處理PPO活性出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，共出現(xiàn)2個(gè)高峰。而10倍稀釋液處理的PPO活性急劇下降，3d后降低到最低水平，后又急劇升高，5d時(shí)達(dá)到最高峰。從整體水平看，接種毒素處理后，寄主PPO活性明顯升高。

2.4CAT活性變化

由圖4可知，毒素處理后，CAT活性較對照明

顯下降。毒素處理后1～4d，10倍稀釋液毒素處理CAT活性從最低值一直處于緩慢上升階段，4d后迅速升高。而5倍稀釋液毒素處理的葉片內(nèi)CAT活性是迅速升高而后又迅速降低，4d時(shí)為最低，后又迅速上升。2個(gè)處理問相比較，5倍稀釋液處理CAT活性較10倍稀釋液處理較高，4d后都處于平穩(wěn)上升階段。而對照處理CAT活性明顯高于毒素處理，3d后處于平穩(wěn)下降趨勢。

3.討論與結(jié)論

在正常狀態(tài)下，由于植物體內(nèi)防御酶(如SOD、POD、CAT等)等活性氧清除系統(tǒng)的存在，使活性氧代謝處于低水平動(dòng)態(tài)平衡之中。但如果植物遭受到外界不良因素的影響后，植物體內(nèi)的防御酶活性會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，以增強(qiáng)植株的抗逆性，最大限度地適應(yīng)不良環(huán)境。

眾多試驗(yàn)表明，接種病原菌的致病因子后，寄主做出的生理反應(yīng)和接種病原菌后寄主的生理反應(yīng)是相似或相同的，這也進(jìn)一步揭示了病原菌的致病機(jī)理。

本研究表明，草坪草葉片接種病原菌粗毒素液后，寄主葉片內(nèi)POD、PPO、PAL活性較對照都有不同程度的提高，并且高濃度毒素處理較低濃度毒素處理酶活性維持較高水平，說明粗毒素液作用寄主后，寄主啟動(dòng)防御酶系統(tǒng)抵制不良侵害，并且侵害程度越大，防御酶活性提高得越多。這進(jìn)一步證實(shí)了草坪草褐斑病菌的致病因子可能為毒素。徐艷(2006)利用水稻紋枯病菌粗毒素(稀釋20～100倍)處理水稻葉片和葉鞘后，POD、PPO、PAL、SOD活性較對照都有不同程度的升高，并且隨著毒素處理時(shí)間的延長，這些酶活性不斷增強(qiáng)。其結(jié)論與本試驗(yàn)結(jié)論一致，原因可能為：水稻和禾本科草坪草同屬于禾本科作物，寄主內(nèi)的防御酶系統(tǒng)可能相同或相近，所以同種病原菌因子處理后，寄主體內(nèi)防御酶系統(tǒng)應(yīng)答反應(yīng)相近。本試驗(yàn)毒素處理后，CAT活性較對照有明顯下降的趨勢，分析其原因可能是由于毒素處理后，葉片內(nèi)活性氧迅速增加，為了消除過量活性氧帶來的傷害，在一定程度上消耗了一定的酶活，使其活性降低。

總之，褐斑病菌粗毒素液處理坪草葉片后，葉片防御酶活性發(fā)生了一系列變化，這在一定程度上反映了病原菌毒素侵染寄主后，寄主在生理上做出的應(yīng)答反應(yīng)，揭示了病原菌毒素在致病過程中的作用，為病原菌和寄主互作及病原菌致病機(jī)理研究提供了理論依據(jù)。在寄主一病原物互作中，由于植物、病原菌的遺傳背景各不相同，各種酶的特性也不盡相同，因此在研究不同的植物與不同的病原菌互作中，寄主防御酶系統(tǒng)也可能會(huì)發(fā)生不同的變化。

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