張一 王鳳忠 杜秉海 靳志剛 李妍 韓明渠 周波 毛志泉

摘要：為了分析比較青縣蘋果再植障礙園與豐產(chǎn)園的土壤細(xì)菌多樣性，利用Quantity One軟件對變性梯度凝膠電泳(DGGE)圖譜進(jìn)行多樣性分析，并對DGGE圖譜上的條帶切膠測序，以分析群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，圖譜各泳帶中的條帶數(shù)目相差不大，但其亮度有一定差異；DGGE圖譜的峰圖中，代表豐產(chǎn)園土壤樣品的峰具有較大的峰面積；再植障礙園與豐產(chǎn)園土壤中的主要菌群都屬于γ變形菌亞門(γ-Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、α變形菌亞門(α-Proteobacteria)；僅存在于再植障礙園樣品中的細(xì)菌屬于厚壁菌門(Firmicutes)、γ變形菌亞門(γ-Proteobacteria)、放線(Actinobacteria)?？梢姡h(huán)渤海灣蘋果產(chǎn)區(qū)豐產(chǎn)園土壤中的細(xì)菌群落與再植障礙園相比擁有較高的豐富度，兩種果園有著相似的細(xì)菌群落多樣性，造成兩種果園細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的細(xì)菌具有多樣性。

關(guān)鍵詞：DGGE技術(shù)；土壤細(xì)菌多樣性；再植障礙

中圖分類號：S154.38⁺1(222)文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942(2012)01-0071-04

果樹再植障礙(Replant problem)是指果園刨除老樹后重茬栽種新樹時新植樹根系發(fā)育不良、幼樹生長緩慢、植株矮小、抗性降低、甚至整株死亡的現(xiàn)象，這種障礙表現(xiàn)在蘋果樹上尤為嚴(yán)重。

前人研究結(jié)果表明，導(dǎo)致再植障礙的原因多源于土壤，主要與果樹根系生長的土壤理化性質(zhì)、土壤生物環(huán)境的變化以及化感作用有關(guān)。同時對再植障礙的發(fā)生機(jī)理做出了一些合理的解釋，并提出了多種可行的應(yīng)對措施。近幾年，有關(guān)土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)變化的研究越來越受到研究者的關(guān)注。

果園土壤是一個微生物種類和數(shù)量豐富，受人為因素影響較大的復(fù)雜的特殊環(huán)境。微生物作為物質(zhì)循環(huán)和能量流動的重要參與者，對環(huán)境因子的變化非常敏感，在果園土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著特別重要的作用。因此，研究果園土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)并分析環(huán)境因子對此結(jié)構(gòu)的影響，對于了解微生物與這個特殊生態(tài)系統(tǒng)的相互關(guān)系有很大的幫助，對于研究再植障礙的發(fā)生機(jī)理有著重要的指導(dǎo)意義。

以往對微生物的研究多建立在傳統(tǒng)的富集、分離、培養(yǎng)基礎(chǔ)上，而在環(huán)境樣品中，能用現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)的微生物僅占微生物總種群數(shù)的0.01％～10％，難以客觀揭示環(huán)境中的微生物多樣性。分子生物技術(shù)的應(yīng)用克服了傳統(tǒng)方法的限制，可以從基因水平上估計(jì)種的豐度和均度、查明種的變異情況等，從而可以更客觀地認(rèn)識環(huán)境中微生物的群落組成?；?6S rDNA的微生物多樣性快速監(jiān)測已成為現(xiàn)代微生物生態(tài)學(xué)研究的重要手段，其中DGGE(denaturing gradient gel elec-trophoresis)技術(shù)是根據(jù)DNA在不同濃度變性劑中解鏈行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化的原理，將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開，從而對微生物群落進(jìn)行評價的一種較先進(jìn)的分子生態(tài)學(xué)方法。由于其具有快速簡便、分辨率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于各種微生物群落多樣性研究中。

河北青縣位于中緯度季風(fēng)區(qū)，有顯著的大陸性季風(fēng)氣候特征：一是季風(fēng)顯著；二是冬寒夏熱，四季分明，春秋短促，氣溫年變差大；三是雨季很短，集中在夏季，7、8兩月降水量占全年的64％～68％，春季少雨，降水量的年際變化也很大。青縣是我國蘋果主要栽植區(qū)，但大片果園開始老化，需進(jìn)行更新，由于土地資源有限，蘋果再植普遍存在。

本試驗(yàn)以青縣蘋果再植障礙園與豐產(chǎn)園定位取得的樣品為研究對象，研究了青縣蘋果園土壤的細(xì)菌群落在不同土層的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及春、夏、秋三季的多樣性變化，并針對兩類果園土壤樣品中細(xì)菌群落的特點(diǎn)，從多樣性、群落構(gòu)成這兩方面進(jìn)行了探討，力圖發(fā)現(xiàn)豐產(chǎn)園與再植障礙園土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性，為蘋果再植障礙發(fā)生機(jī)理的研究和防治提供科學(xué)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1主要試劑和儀器

E.Z.N.A.Soil DNA Kit和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自美國OMEGA公司；Taq DNA聚合酶、dNTP及相關(guān)試劑購自大連寶生物工程公司；所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；基因掃描由上海生工生物工程有限公司完成。

DGGE儀，美國Bio-Rad公司；T-GradientPCR儀，德國Biometra公司；GelDoc-It凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司；5810R型離心機(jī)(冷凍型)，德國Eppendorf公司。

1.2土壤樣品的采集及理化指標(biāo)的測定

分別于2009年4月28日～5月1日(春季，樣品標(biāo)記為sp)、7月26日～28日(夏季，樣品標(biāo)記為su)、10月9日～11日(秋季，樣品標(biāo)記為au)共3次在河北青縣蘋果園采集土壤樣品。設(shè)置再植障礙園(標(biāo)記為1)與豐產(chǎn)園(標(biāo)記為2)兩個取樣點(diǎn)，同一取樣點(diǎn)選取0～20cm(標(biāo)記為a)、20～40cm(標(biāo)記為b)兩個深度，每個深度重復(fù)采樣3次，土壤樣品混勻后于0℃保存。

1.3土壤樣品總DNA的提取

樣品基因組總DNA的提取、純化使用E，Z.N.A.Soil DNA Kit(OMEGA，USA)進(jìn)行。

1.4 DGGE分析

1.4PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增及定量DGGE使用的上游引物為GC-357F(5'-CGCCCGC-CGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGCGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3')，下游引物為517R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')。反應(yīng)體系為：DNA模板20ng，上下游引物各10pmol，TaqDNA聚合酶2.5U，dNTP(10mmol/L)1μl，10×PCR buffer(不含MgCl₂)5μl，MgCl₂3μl，ddH20補(bǔ)足至50μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，56℃復(fù)性1min，72℃30s，25個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保溫。PCR產(chǎn)物用濃度為0.8％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化。

將純化后的PCR產(chǎn)物利用分光光度計(jì)測量260nm與280nm下的吸光值，以測定每微升產(chǎn)物中的DNA含量，并精確吸取含有2000ng DNA的PCR產(chǎn)物，-20℃儲存待用。

1.4.2電泳嚴(yán)格按照Bio-Rad的DGGE說明手冊步驟操作。

1.4.3連接測序 使用滅菌后的手術(shù)刀片將DGGE膠片上的條帶切下，并按順序編號。切下的凝膠置于20μl無菌ddH₂O中，4℃靜置12h后12000 r/min離心1min，得到的上清液即為目的條帶的DNA。

以離心后的上清液為模板，使用上游引物357F(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3')和下游

引物517R(5'-ATFACCGCGGCTGCTGG-3')進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系及程序與1.4.1中相同。

將上述擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T Vector連接，送樣測序。

2.結(jié)果與分析

2.1青縣蘋果再植障礙園與豐產(chǎn)園土壤樣品的細(xì)菌群落的DGGE圖譜

從圖1可以看出，1～12號泳帶中條帶數(shù)目相差不大，說明兩種果園土壤中的細(xì)菌群落擁有相似的多樣性。其中e、f、h、i、a、j、k、m出現(xiàn)在所有樣品中，代表土壤中的土著細(xì)菌群落；L、b、c、d僅出現(xiàn)在再植障礙園的樣品中。

2.2 DGGE峰圖分析

DGGE直觀圖譜中直接反應(yīng)的信息量較少，所以采用Quantity one對圖1中所示各泳道條帶數(shù)目和亮度進(jìn)行對比分析，其結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯觯袠悠返姆逯饕杏赗f0.3～0.6和Rf0.9～1.0的區(qū)域中，這兩個區(qū)域的峰擁有較大的峰面積，說明這些峰代表的細(xì)菌是環(huán)渤海灣蘋果產(chǎn)區(qū)果園土壤中的主要細(xì)菌類群。豐產(chǎn)園土壤樣品的峰圖擁有較大的峰面積，這說明豐產(chǎn)園土壤中的細(xì)菌群落擁有較高的豐富度。

2.3 DGGE圖譜中主要條帶的定性分析

對DGGE圖譜中的主要條帶進(jìn)行定性分析，結(jié)果顯示存在于所有樣品中的條帶e、f、i、k、m代表的細(xì)菌類群屬于放線菌門(Actinobacteria)，h代表的細(xì)菌類群屬于α變形菌門(α-Proteobac-teria)，a、j代表的細(xì)菌類群屬于γ-變形菌亞門(γ-Proteobacteria)；僅存在于再植障礙園樣品中的條帶L、c代表的細(xì)菌類群屬于放線菌門(Acti-nobacteria)，b代表的細(xì)菌類群屬于厚壁菌門(Fir-micutes)，d代表的細(xì)菌類群屬于γ-變形菌亞門(γ-Proteobacteria)。

3.討論與結(jié)論

DGGE是一種快速、可靠的檢測土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的指紋圖譜技術(shù)。本研究利用該技術(shù)對環(huán)渤海灣蘋果產(chǎn)區(qū)再植障礙園與豐產(chǎn)園土壤樣品的細(xì)菌群落組成進(jìn)行對比研究，揭示了此地區(qū)蘋果園土壤中細(xì)菌組成的多態(tài)性。

本試驗(yàn)通過直觀分析和峰圖對比發(fā)現(xiàn)，環(huán)渤海灣蘋果產(chǎn)區(qū)豐產(chǎn)園土壤中的細(xì)菌群落與再植障礙園相比擁有較高的豐富度；兩類果園土壤中的細(xì)菌群落擁有相似的多樣性；再植障礙園與豐產(chǎn)園土壤中的主要菌群都屬于厚壁菌門(Firmi-cutes)、γ變形菌門(γ-Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、α變形菌門(α-Proteobacte-ria)；僅存在于再植障礙園樣品中的細(xì)菌屬于厚壁菌門(Firmicutes)、γ變形菌門(γ-Proteobacte-ria)、放線菌門(Actinobacteria)。此結(jié)果指出了環(huán)渤海灣蘋果產(chǎn)區(qū)果園土壤中的主要菌群，同時也說明了造成兩種果園細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的細(xì)菌所具有的多樣性。