張樂(lè) 陳為序 董慧 陳桂玲 余利 李興鋒

摘要：利用新開(kāi)發(fā)的功能型共顯性分子標(biāo)記usw47對(duì)86份供試普通小麥品種(系)的鎘吸收基因Cdu1組成進(jìn)行了檢測(cè)和分析，結(jié)果表明：59個(gè)材料具有低鎘吸收型對(duì)應(yīng)的375bp特異帶，占68.60％；27個(gè)材料具有高鎘吸收型對(duì)應(yīng)的225bp特異帶，占31.40％。在47份小偃6號(hào)的衍生材料中，有74.47％的衍生品種(系)在鎘吸收基因Cdu1基因位點(diǎn)上與小偃6號(hào)一致，具有低鎘吸收型的優(yōu)良等位變異；25.53％的衍生后代具有高鎘吸收型的等位變異類(lèi)型。山東省近年選育的小麥材料中多數(shù)具有低鎘吸收型的特異條帶。

關(guān)鍵詞：小麥；鎘吸收基因；Cdu1；功能型分子標(biāo)記

中圖分類(lèi)號(hào)：Q754文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942(2012)01-0006-05

鎘(Cd)是一種有毒金屬，以微量形式自然存在于幾乎所有的土壤中，被認(rèn)為是最重要的重金屬環(huán)境污染物之一。農(nóng)業(yè)、采礦業(yè)以及工業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)使大量的鎘進(jìn)入環(huán)境中，并隨著污泥農(nóng)用及污灌等進(jìn)入農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，造成土壤鎘污染日趨嚴(yán)重。當(dāng)鎘在土壤環(huán)境中含量達(dá)到或超過(guò)傷害閾值時(shí)，就會(huì)抑制作物根系生長(zhǎng)，降低其光合作用和葉綠素含量，破壞作物體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)，干擾碳、氮代謝及水分和養(yǎng)分吸收，使質(zhì)膜透性加大等，表現(xiàn)出明顯的中毒癥狀，如植株矮小、葉片褪綠、生長(zhǎng)遲緩等，嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量。更為嚴(yán)重的是，鎘能夠在作物體內(nèi)，特別是籽粒中大量積累，并通過(guò)食物鏈傳遞和富集，從而危害人體健康，日本的骨痛病就是鎘污染大米所致。含鎘食物，尤其含鎘谷物和蔬菜是人體內(nèi)鎘的主要來(lái)源。因此，如何降低鎘在農(nóng)作物中的富集受到廣泛關(guān)注。目前，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)的食品法規(guī)委員會(huì)已設(shè)定了小麥中鎘含量的標(biāo)準(zhǔn)值，為0.2mg/kg(CODEX STAN193-1995，2009)。

部分硬質(zhì)小麥品種具有富集鎘元素使谷物中鎘水平超過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)值的基因潛力，該性狀由主效基因控制，該基因被定名為Cdu1，并被定位于5B染色體的長(zhǎng)臂上。了解小麥品種Cd吸收的遺傳基礎(chǔ)及其基因組成，可以為選育低鎘吸收型品種提供理論依據(jù)。分子標(biāo)記輔助選擇在育種中的應(yīng)用越來(lái)越受到重視。ScOpc20是一個(gè)SCAR標(biāo)記，已經(jīng)被成功用于培育低鎘吸收型的小麥新品種，但由于它是一個(gè)與高鎘含量相關(guān)的顯性標(biāo)記，因此限制了該標(biāo)記在回交育種中的應(yīng)用。Wiebe等(2010)開(kāi)發(fā)了一個(gè)與作物鎘吸收性狀基因變異共分離的EST衍生標(biāo)記(XBF474090)，該標(biāo)記已經(jīng)被成功轉(zhuǎn)化為一個(gè)共顯性CAPS標(biāo)記，并被定名為usw47。在用限制性內(nèi)切酶Hpyl88 I對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化之后，經(jīng)電泳分析，該標(biāo)記可用于檢測(cè)鎘吸收性狀基因的兩個(gè)等位基因，并成功將96個(gè)小麥品系分成低鎘吸收型或高鎘吸收型。因此，usw47在低鎘吸收型小麥新品種的選育中具有廣闊的應(yīng)用前景。

本試驗(yàn)利用鎘吸收基因Cdu1的功能型分子標(biāo)記usw47對(duì)86份小麥材料進(jìn)行檢測(cè)，旨在明確這些材料中鎘吸收等位基因的基因組成，同時(shí)分析探討了其中的小偃6號(hào)及其衍生系的鎘吸收基因的等位變異，以期為培育低鎘小麥品種奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

所用材料共86份，見(jiàn)表1。其中1～52號(hào)包括小偃6號(hào)、其親本小偃96和鄭引4號(hào)、兩個(gè)姊妹系品種小偃4號(hào)和小偃5號(hào)及小偃6號(hào)的衍生材料，由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所李振聲課題組提供；中國(guó)春、J-11、IKE、Wx1D、江蘇白火麥、Chancellor、銘賢169為遺傳材料；60～86號(hào)材料為山東省近年育成品種，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。所有材料在2009～2010年國(guó)家小麥改良分中心泰安試驗(yàn)基地統(tǒng)一種植，田間常規(guī)管理。

1.2DNA的提取

每個(gè)品種選取幼嫩葉片5～6cm，經(jīng)液氮冷凍后研磨成粉末，放入2ml離心管中，采用SDS一酚法提取小麥基因組DNA，并用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量，用于鎘吸收基因Cdu1位點(diǎn)的分子檢測(cè)。

1.3特異性標(biāo)記

鎘吸收基因相關(guān)標(biāo)記usw47序列參考網(wǎng)站http：//maswheat.ucdavis.edu/protocols/Cadmium/index.htm，所用特異性引物由上海生工公司合成，分別為usw47-F：5'-GCTAGGACTTGAT-TCATTGAT-3'，usw47-R：5'-AGTGATCTA-AACGTTCTTATA-3'。

1.4PCR擴(kuò)增及酶消化

PCR反應(yīng)體系均為20μl，含10×PCR buffer2.5μl，2mmol/L MgCl₂2μl，200mmol/L dNTPs1.5μl，每個(gè)引物1μl(約10ng)，基因組DNA 3μl(30～100ng)，TaqDNA聚合酶1U，其余由ddH₂0補(bǔ)齊。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃復(fù)性30s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物首先經(jīng)Hpy 188I限制性內(nèi)切酶消化，酶消化反應(yīng)體系均為15μl，含PCR產(chǎn)物4μl，NEB Hpyl88I 0.25μl，NEB buffer4 1.5μl，ddH₂0 9.25μl。酶消化程序?yàn)椋?7℃反應(yīng)1h；65℃酶變性20min；最后維持在10％。

消化產(chǎn)物采用6％～8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測(cè)，1×TE緩沖溶液，凝膠經(jīng)硝酸銀染色，顯影后采用天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描成像。

2.結(jié)果與分析

usw47為共顯性標(biāo)記，PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hpy l88 I消化后，電泳結(jié)果顯示出兩條差異帶，大小分別為375bp和225bp，分別對(duì)應(yīng)低鎘吸收型等位基因和高鎘吸收型等位基因。此標(biāo)記清晰易讀，重復(fù)性好，可用于檢測(cè)鎘吸收基因Cdu1位點(diǎn)上等位基因相應(yīng)的類(lèi)型。

本試驗(yàn)所用86份小麥材料中，59份材料擴(kuò)增出375bp的特異性條帶，為低鎘吸收型，占68.60％；27份材料擴(kuò)增出225bp的特異性條帶，為高鎘吸收型，占31.40％(表1)。

小偃6號(hào)及其親本小偃96和鄭引4號(hào)、姊妹系小偃4號(hào)和小偃5號(hào)均擴(kuò)增出375bp的特異性條帶，均為低鎘吸收型。47份小偃6號(hào)的衍生材料中，有35份材料擴(kuò)增出375bp的特異性條帶，占74.47％；有12份擴(kuò)增出225bp的特異性條帶，分別是白春5號(hào)、晉麥41、晉麥60、魯麥14、陜213、陜253、西農(nóng)2258、小偃15、鄭麥9023、鄭麥9405、鄭農(nóng)16、鄭優(yōu)7號(hào)，占25，53％(表1)。部分小偃6號(hào)衍生材料的多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

遺傳材料中國(guó)春、Chancellor、J-11、IKE、江蘇白火麥和銘賢169及山東省重要的小麥品種如

濟(jì)麥19、濟(jì)南17、山農(nóng)15、臨麥2號(hào)、臨麥4號(hào)、濰麥8號(hào)、煙農(nóng)19等擴(kuò)增出225bp的特異帶，為高鎘吸收材料；而濟(jì)麥20、濟(jì)麥21、濟(jì)麥22和多數(shù)山農(nóng)系列品種為低鎘吸收類(lèi)型(表1)。部分遺傳材料及山東省育成品種的多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.討論與結(jié)論

鎘是一種重要的環(huán)境和工業(yè)毒物，也是一種半衰期很長(zhǎng)(長(zhǎng)達(dá)10～35年)的多器官、多系統(tǒng)毒物，隨著人類(lèi)生活生產(chǎn)活動(dòng)，逐漸在土壤中及作物體內(nèi)積累，不僅對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育、光合特性、產(chǎn)量、品質(zhì)等理化性狀產(chǎn)生影響，而且可經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體，嚴(yán)重影響人類(lèi)健康。植物硫代謝、抗氧化系統(tǒng)和Cd²⁺跨膜運(yùn)輸是植物對(duì)重金屬鎘響應(yīng)的主要途徑。但，李妍發(fā)現(xiàn)，抗氧化酶未對(duì)鎘脅迫條件下的小麥幼苗起到明顯的保護(hù)作用。因此，分析作物的鎘耐受差異、緩解鎘對(duì)農(nóng)作物的毒害、培育低鎘吸收型作物品種成為研究的焦點(diǎn)。小麥?zhǔn)俏覈?guó)北方地區(qū)的主要糧食作物之一，了解現(xiàn)有小麥品種鎘吸收的遺傳基礎(chǔ)及其基因組成，對(duì)培育低鎘吸收型小麥品種意義重大。

本研究利用鎘吸收基因的功能型分子標(biāo)記usw47對(duì)86份小麥品種(系)進(jìn)行分子檢測(cè)，結(jié)果表明，大多數(shù)材料(68.60％)具有低鎘吸收型所對(duì)應(yīng)的等位變異。其中，小偃6號(hào)及其親本小偃96和鄭引4號(hào)、姊妹系小偃4號(hào)和小偃5號(hào)、35個(gè)衍生材料均為低鎘吸收型，說(shuō)明骨干親本小偃6號(hào)具有低鎘吸收型的優(yōu)良基因潛力，而其大多數(shù)衍生材料能很好地保存低鎘吸收型的優(yōu)良基因等位變異。遺傳材料除WxlD為低鎘吸收類(lèi)型外，中國(guó)春、J-11、IKE、江蘇白火麥、Chancellor和銘賢169均為高鎘吸收型，不宜用于低鎘吸收型小麥新品種的選育。

在27個(gè)山東省育成的小麥品種中，18個(gè)為低鎘吸收型，占66.67％；9個(gè)為高鎘吸收型，占33.33％。一些育成年限稍長(zhǎng)的品種，如魯麥14、濟(jì)南17，多為高鎘吸收型；而大多數(shù)新育成的品種，如良星99、山農(nóng)14、山農(nóng)16、煙農(nóng)23、煙農(nóng)24、煙農(nóng)25、濟(jì)麥20和濟(jì)麥21等，均為低鎘吸收型品種，說(shuō)明這部分品種可以用作選育低鎘小麥的親本。值得注意的是山農(nóng)14和山農(nóng)15雖都是濟(jì)南17(高鎘吸收型)的后代，但一個(gè)為低鎘吸收型，一個(gè)為高鎘吸收型，這可能是由雜交組合的另一個(gè)親本不同造成的。

本研究?jī)H是利用功能標(biāo)記usw47對(duì)普通小麥的鎘吸收基因類(lèi)型進(jìn)行初步鑒定，對(duì)于鑒定出的低鎘吸收型小麥品種，還需通過(guò)土培和水培相結(jié)合的方法進(jìn)一步驗(yàn)證。隨著小麥基因組學(xué)研究的進(jìn)展和研究技術(shù)的提高，將會(huì)有更多的功能標(biāo)記被開(kāi)發(fā)出來(lái)并用于準(zhǔn)確檢測(cè)相關(guān)基因位點(diǎn)的等位變異。

參考文獻(xiàn)：

[1]顧繼光，林秋奇，胡韌，等.土壤一植物系統(tǒng)中重金屬污染的治理途徑及其研究展望[J].土壤通報(bào)，2005，36(1)：128-133.

[2]趙其國(guó)，周炳中，楊浩，等.江蘇省環(huán)境質(zhì)量與農(nóng)業(yè)安全問(wèn)題研究[J].土壤，2002，34(1)：1-8.

[3]Das P，samantaray S，Rout G R Studies on cadmium toxicityin pjans：a review[J].Environmental Pollution，1997，98：29-36.

[4]何俊瑜，任艷芳，朱誠(chéng)，等.鎘脅迫對(duì)鎘敏感水稻突變體活性氧代謝及抗氧化酶活性的影響[J].生態(tài)環(huán)境，2008，17(3)：1004-1008.