劉霞 李偉 范小娜

摘要：加入不同濃度的臍橙（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｏｓｂｅｃｋ）黃酮，研究臍橙黃酮體外清除活性氧自由基鄰苯三酚的作用，并與維生素Ｃ、體積分數(shù)為５０％的乙醇的作用進行比較。結果表明，臍橙黃酮濃度為３．０１ ｍｇ／ｍＬ時對鄰苯三酚的清除率與１ ｍｇ／ｍＬ維生素Ｃ相比無顯著差異（Ｐ＞０．０５），與體積分數(shù)為５０％的乙醇及去離子水相比差異極顯著（Ｐ＜０．０１）。臍橙黃酮具有較強地清除體外活性氧自由基的作用。

關鍵詞：臍橙（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｏｓｂｅｃｋ）；黃酮；抗氧化；活性氧自由基

中圖分類號：Ｓ６６６．４文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）14－3050-02

Study on in vitro Antioxidation of Navel Orange Flavonoids

ＬＩＵ Ｘｉａａ，ＬＩ Ｗｅｉｂ，ＦＡＮ Ｘｉａｏ－ｎａｃ

（ａ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ；ｂ． Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ｃ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｇａｎｎａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇａｎｚｈｏｕ ３４１０００，

Ｊｉａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎａｖｅｌ ｏｒａｎｇｅ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｏｓｂｅｃｋ） ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ ａｆｔｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｖｅｌ ｏｒａｎｇｅｓ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｗａｓ ａｄｄｅｄ． Ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ａｎｄ ５０％ ａｌｃｏｈｏｌ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ （Ｐ＞０．０５） ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ １ ｍｇ／ｍＬ ｖｉｔａｍｉｎ Ｃ ａｎｄ ３．０１ ｍｇ／ｍＬ ｎａｖｅｌ ｏｒａｎｇｅｓ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ； ｈｏｗｅｖｅｒ， ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｖｅｌ ｏｒａｎｇｅｓ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ was ｖｅｒｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ（Ｐ＜０．０１） ｆｒｏｍ ｔｈａｔ ｏｆ ５０％ ｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ＣＫ， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｎａｖｅｌ ｏｒａｎｇｅｓ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｎａｖｅｌ ｏｒａｎｇｅｓ； ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ； ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ； ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ

贛南臍橙（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｏｓｂｅｃｋ）營養(yǎng)豐富，含有人體所必需的各類營養(yǎng)成分。贛南氣候溫暖，雨水充沛，晝夜溫差大，具有得天獨厚的氣候資源優(yōu)勢，非常適宜種植臍橙，臍橙皮中含有豐富的天然黃酮類化合物［１］。研究表明黃酮類化合物具有降脂、抗血栓、抗氧化、抗衰老、抗心率失常等作用，因而廣泛用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)，具有極廣的開發(fā)應用前景［２－４］。研究通過比較維生素Ｃ、乙醇和臍橙黃酮對鄰苯三酚的清除率，并研究不同濃度臍橙黃酮清除活性氧自由基的作用，旨在為更加深入地研究臍橙黃酮的作用提供一定的依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１主要儀器ＵＶ－１６０１紫外可見分光光度計購自日本島津公司，ＥＹＥＬＡＮ－１００１旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海愛明儀器有限公司，ＳＨＺ－ＪＩＩＡ型循環(huán)水式真空泵購自西安波意爾精密儀器有限公司。

１．１．２原料與試劑橙皮粉為市售贛南臍橙果皮在５０ ℃恒溫烘干后粉碎過５０目篩所得，純度為９９．０％的橙皮苷標準品購于中國藥品生物制品檢定所，三羥甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、鄰苯三酚、維生素Ｃ、無水乙醇、ＮａＯＨ、HCl均為分析純。

１．２方法

１．２．１試劑的配制０．２ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ：稱?。玻矗玻?ｇ Ｔｒｉｓ，以去離子水溶解定容至１００ ｍＬ；Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ－ＥＤＴＡ緩沖液：５０ ｍＬ ０．２ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ與４６ ｍＬ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ混合，內(nèi)含１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．２，定容至１００ ｍＬ；４５ ｍｍｏｌ／Ｌ鄰苯三酚：稱?。担叮罚?ｍｇ鄰苯三酚，用０．０１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣＩ溶解定容至１００ ｍＬ，溶液須臨用前現(xiàn)配；１ ｍｇ／ｍＬ維生素Ｃ：稱取５０ ｍｇ維生素Ｃ，用去離子水溶解定容至５０ ｍＬ。

１．２．２樣品的處理準確稱?。?ｇ樣品放入圓底燒瓶中，加入１００ ｍＬ體積分數(shù)為５０％的乙醇，于７０ ℃提?。?ｈ，抽濾，從濾液回收乙醇，使?jié)饪s液ｐＨ ５，靜置過夜，待黃酮全部沉淀析出，離心，得黃酮［５］。

１．２．３橙皮苷標準曲線的繪制準確稱量２．２３８ ｍｇ純度為９９．０％的橙皮苷標準品，用含１ ｇ／Ｌ ＮａＯＨ的體積分數(shù)為７５％的乙醇溶液溶解并定容于２５ ｍＬ容量瓶中，搖勻，得濃度為８９．５２ μｇ／ｍＬ標準品溶液。準確吸取該標準品溶液０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０ ｍＬ分別置于１０ ｍＬ比色管中，用含１ ｇ／Ｌ ＮａＯＨ的體積分數(shù)為７５％的乙醇溶液定容至刻度。標準品溶解１ ｈ后，以含１ ｇ／Ｌ ＮａＯＨ的體積分數(shù)為７５％的乙醇溶液為空白，在３６０ ｎｍ波長處測定這一系列溶液的吸光度，以吸光度（ｙ）為縱坐標、橙皮苷濃度（ｘ）為橫坐標作標準曲線［６］，該標準曲線的回歸方程＝０．０１８ １ｘ－０．０６９ ２，ｒ＝０．９９９ ７。

１．２．４樣品中黃酮含量的測定將通過方法１．２．２所得的黃酮用含１ ｇ／Ｌ ＮａＯＨ的體積分數(shù)為７５％的乙醇溶液溶解并定容于５０ ｍＬ容量瓶中，搖勻，用移液管精確移?。埃?ｍＬ于１０ ｍＬ比色管中，用方法１．２．３測定其在３６０ ｎｍ的吸光度，然后按照下述公式計算贛南臍橙皮中的黃酮得率：黃酮得率＝［（ｙ＋０．０６９ ２）×５ ０００×１０－６／（０．０１８ １×５）］×１００％。式中，ｙ為黃酮溶液在３６０ ｎｍ處的吸光度；５ ０００為黃酮的稀釋倍數(shù)；１０－６為μｇ與ｇ之間的單位換算；５為樣品質(zhì)量（ｇ）。計算得黃酮得率為３．０１％，黃酮濃度為３．０１ ｍｇ／ｍＬ。

１．２．５試驗設計

１）不同清除劑對鄰苯三酚的清除率。?。磦€試管標記為１、２、３、４，每組中分別加入４．５ ｍＬ ｐＨ ８．２的Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ－ＥＤＴＡ緩沖液，于２５ ℃水浴預熱２０ ｍｉｎ，然后在１、２、３、４號管中分別加入3.01 mg/mL臍橙黃酮、１ ｍｇ／ｍＬ維生素Ｃ、體積分數(shù)為５０％的乙醇和去離子水各０．１ ｍＬ，再各加入鄰苯三酚０．４ ｍＬ，搖勻，于３２１ ｎｍ處測定作用１、２、４、６、８、１０ ｍｉｎ時的吸光度，３次重復。清除率ｄ＝［（Ａ空白－Ａ樣品）／Ａ空白］×１００％。

２）不同濃度臍橙黃酮對鄰苯三酚的清除率。將通過方法１．２．２所得的黃酮用含１ ｇ／Ｌ ＮａＯＨ的體積分數(shù)為７５％的乙醇溶液溶解并定容于５０ ｍＬ容量瓶中，搖勻；分別精密量取該溶液，用含１ ｇ／Ｌ ＮａＯＨ的體積分數(shù)為７５％的乙醇溶液稀釋制成０．３、０．６、０．９、１．２、１．５、１．８、２．１、２．４、２．７和３．０ ｍｇ／ｍＬ的臍橙黃酮溶液。仿前述“不同清除劑對鄰苯三酚的清除率”的研究方法，研究不同濃度臍橙黃酮對鄰苯三酚的清除率。

１．２．６統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)使用ＳＰＳＳ １１．５軟件統(tǒng)計。

２結果與分析

２．１不同清除劑對鄰苯三酚的清除率

由表1可知，作用ｌ、２、４、６、８、１０ ｍｉｎ后，３．０１ ｍｇ／ｍＬ臍橙黃酮對鄰苯三酚的清除率分別為３９．９３％、４５．４７％、３４．９６％、２８．９５％、２４．７３％、１９．９２％，隨著作用時間的延長，清除率先升后降，平均清除率為３２．３３％±９．６０％，１ ｍｇ／ｍＬ維生素Ｃ和體積分數(shù)為５０％的乙醇對鄰苯三酚的平均清除率分別為３９．０７％±４．７８％和７．９９％±４．２２％。３．０１ ｍｇ／ｍＬ臍橙黃酮對鄰苯三酚的清除率與體積分數(shù)為５０％的乙醇及去離子水（對照）相比差異極顯著（Ｐ＜０．０１），與１ ｍｇ／ｍＬ維生素Ｃ間無顯著差異（Ｐ＞０．０５）。

２．２不同濃度臍橙黃酮對鄰苯三酚的清除率

由圖１可知，隨著臍橙黃酮濃度的增大，對鄰苯三酚的清除率提高，當臍橙黃酮濃度為０．３ ｍｇ／ｍＬ時，對鄰苯三酚的清除率低于１０％，說明提取物對鄰苯三酚的清除率與臍橙黃酮濃度有關。

３結論與討論

上述結果表明，臍橙皮提取物有類似超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的作用，能較強地清除活性氧自由基（Ｏ２－·），作用效果隨著濃度的增加而增強，呈非線性的劑量關系。橙皮苷是柑橘黃酮中最重要的一種，抗氧化活性較低，需要在較高濃度下才表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。試驗中臍橙黃酮和維生素Ｃ都有很強的體外清除活性氧自由基的作用，可應用于抗氧化保健食品中。臍橙黃酮濃度為３．０１ ｍｇ／ｍＬ時對鄰苯三酚的清除率與１ ｍｇ／ｍＬ維生素Ｃ相比無顯著差異（Ｐ＞０．０５），說明臍橙黃酮濃度比維生素Ｃ濃度大才達到相似的清除率。因此，臍橙作為贛南地區(qū)的特產(chǎn)，它將是一種有應用前景的活性氧自由基清除劑，其藥用價值可被大力開發(fā)利用。

參考文獻：

［１］ 蔡定建，謝志鵬，羅六保，等． 臍橙皮中黃酮類化合物與果膠的分離和提取研究［Ｊ］． 分析測試技術與儀器，２００６，１２（４）：２３９－２４２．

［２］ 劉成倫． 黃酮類化合物抗氧化性質(zhì)的研究進展［Ｊ］． 食品研究與開發(fā)，２００６，２７（５）：１５８－１６８．

［３］ 張玉萌． 黃酮類化合物抗腫瘤作用分子機制研究進展［Ｊ］． 中國藥物應用與監(jiān)測，２００６（６）：５０－５３．

［４］ 王瑋，王琳． 黃酮類化合物的研究進展［Ｊ］． 沈陽醫(yī)學院學報，２００２，４（２）：１１５－１１９．

［５］ 張國文，楊佳，何力，等． 醇法提取贛南臍橙皮中黃酮類化合物的工藝研究［Ｊ］．南昌大學學報（工科版），２００９，３１（３）：２０５－２０９．

［６］ 盧靜華，王亞娟，于玲． 陳皮中橙皮苷超聲提取工藝研究［Ｊ］． 時珍國醫(yī)國藥，２００６，1７（４）：６０４－６０７．