王正輝等

臍血間充質干細胞是一類從臍帶血中分離和培養(yǎng)的成體干細胞，具有高度自我更新和多向分化的潛能。臍血間充質干細胞的這些特性，吸引了眾多國內外學者的目光，目前，臍血間充質干細胞移植的臨床治療取得了一定進展。本文就臍血間充質干細胞的采集分離、純化及生物學特性及研究前景作一簡要綜述。

臍帶血是指胎兒娩出，臍帶結扎，殘留在臍帶和胎盤靠近胎兒段內的血液。臍帶血中含有兩種干細胞：造血干細胞（Hematopoietic stem cells，HSCs）和間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）。臍帶血造血干細胞異體移植后發(fā)生免疫排斥反應的可能性極低[1]，它已應用于臨床治療，主要用于治療造血系統(tǒng)疾?。ò籽?、惡性淋巴瘤、骨髓瘤）、糖尿病、肝臟疾病等。間充質干細胞具有高度的自我更新和多向分化的潛能，這些特性近年來引起了國內外眾多研究者的廣泛關注。Lee等[2]將冷藏0.1～5年的臍血單個核細胞培養(yǎng)3～5周，獲得貼壁的細胞呈現(xiàn)成纖維細胞樣形態(tài)，并具有間充質細胞的免疫表型，表明可以長期凍存保存臍血間充質干細胞。2000年，Erices[3]首次報道臍血中含有間充質干細胞，其形態(tài)和免疫學表型和骨髓間充質干細胞相似。Karen [4]認為臍血間充質干細胞分離成功的關鍵在于：①從臍血中采集分離時間不超過15h；②臍血的量不少于33ml；③單個核細胞量不少于1×108個。但臍血間充質干細胞分離成功率低[5-6]，甚至有些學者認為臍血中沒有間充質干細胞[7-9]。且隨著胎齡的增加，臍血間充質干細胞的數(shù)量、生長活性及分離培養(yǎng)的成功率逐漸下降。

1影響臍血間充質干細胞分離培養(yǎng)成功的因素

1.1 臍血的采集量：個體差異較大，與產婦分娩的方式、采集者操作水平等因素有關，臍血采集量越大、分離的成功率越高。

1.2采集到分離的時間：要求24h內完成分離接種，時間越短分離培養(yǎng)的成功率越高。

1.3 分離方法及培養(yǎng)條件的優(yōu)化：目前臍血間充質干細胞的分離，完全套用骨髓間充質干細胞的分離方法，這可能是導致臍血間充質干細胞分離成功率低的重要原因之一。國內外眾多學者對臍血間充質干細胞培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，但由于條件的限制，尚無統(tǒng)一的評價標準，難以進行比較。

1.4首次接種密度：接種密度過大，細胞接觸抑制，生存空間不足，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分消耗過快；密度過低無法形成細胞生長所需的環(huán)境或者原代細胞發(fā)生老化。

1.5血清濃度：文獻報道血清濃度10%～20%，一般認為低濃度血清更利于臍血間充質干細胞生長，高濃度的血清含有大量促進細胞增殖的因子，細胞增殖迅速，容易過早發(fā)生老化。胎牛血清中異種蛋白隨臍血間充質干細胞移植入人體后會增加細胞毒性反應或者免疫排斥反應的風險。國內有報道，通過從臍血中分離自體血清成功培養(yǎng)出臍血間充質干細胞，可以大大降低免疫反應；但自體血清量少，則難以支持臍血間充質干細胞長期大量擴增。

1.6 細胞因子的使用：可以向純化后的臍血間充質干細胞中添加bFGF、EGF、GM-CSF、IL-3 等細胞因子[10]。

1.7 pH值：偏酸性的環(huán)境抑制造血干細胞及破骨樣細胞的生長，有利于臍血間充質干細胞的純化。

2臍血間充質干細胞的分離方法

2.1密度梯度離心法：為提高單個核細胞分離的成功率，目前多采用自然沉降與密度梯度離心相結合的方法。加速紅細胞沉降，可以向臍血中加入大分子物質，如：明膠[12]、羥乙基淀粉、甲基纖維素等，也可以通過紅細胞裂解液氯化銨去除紅細胞。干細胞的密度與單個核細胞密度基本相同，在高速離心條件下通過分層液Ficoll或Percoll將單個核細胞從臍血中分離出來。該方法操作簡單，獲得的MSCs量可以滿足體外培養(yǎng)所需細胞密度要求。

2.2 貼壁培養(yǎng)法：體外培養(yǎng)的臍血間充質干細胞有貼壁生長的特性，但該方法提取的細胞純度不足，可有大量紅細胞、巨噬細胞、破骨樣細胞等細胞成分。多次傳代后仍可見雜質細胞，對間充質干細胞增殖有一定影響。目前多主張將密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)方法相結合，可獲得較理想的分離效果。

2.3 免疫磁珠分選：表面包被抗體的磁珠與表面標志抗原特異性結合，通過正選或負選將臍血間充質干細胞分離出來。該方法對細胞活性影響較大。

2.4流式細胞儀分選：將干細胞大小和表面標記進行分離，獲得的細胞純度高。免疫磁珠和流式細胞儀分選的方法，對臍血量要求大、抗體價格昂貴，對臍血間充質干細胞的活性影響較大，不適合實驗室推廣。

2.5 單細胞克隆方法：該方法技術要求較高，難以獲得大量的臍血間充質干細胞。

3臍血間充質干細胞的培養(yǎng)

臍血間充質干細胞適合在偏酸性的環(huán)境中生長，目前常用的培養(yǎng)基有DMEM/F12、LG-DMEM、α-MEM、IMDM培養(yǎng)基。一般認為間充質干細胞專用Mesencult TM 培養(yǎng)基培養(yǎng)功率較高，但該培養(yǎng)基價格昂貴限制其廣泛地使用。如：Both 等[13]用α-MEM 培養(yǎng)基、低密度接種培養(yǎng)MSCs 優(yōu)于高密度下DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，添加地塞米松能促進細胞生長；Yang 等[14]采用含10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基僅有23%的標本成功培養(yǎng)出MSCs；Liu 等[15]以l×l07cells/cm2 接種密度于含有20%FBS 的IMDM 培養(yǎng)基中，結果144份臍帶血中有108份通過原代培養(yǎng)成功地培養(yǎng)出間充質干細胞，占總數(shù)的75%。加入人堿性成纖維細胞生長因子 bFGF、人表皮生長因子EGF、粒-巨噬細胞集落刺激因子GM-CSF、 IL-3等細胞因子[16]對UCB-MSC的生長起促進作用。優(yōu)化培養(yǎng)可以使原代培養(yǎng)的成功率達到90%以上。目前認為細胞因子作為蛋白質大分子物質，通過結合與作用于受體的胞外域來激活細胞表面受體，并能夠識別與結合化學信號，觸發(fā)靶細胞產生特異的生理效應。但這些細胞因子通過何種途徑進行細胞間的信號轉導，其機制尚還沒有突破性研究。

4臍血間充質干細胞的鑒定

4.1形態(tài)學觀察：原代臍血間充質干細胞初貼壁時呈圓形或橢圓形，散在分布，雙側伸出突起。折光性較強，突起伸長后呈現(xiàn)單個核的梭形。5～7天可見多個細胞相互聚集形成集落，原代細胞表現(xiàn)為異質性可見梭形、多角形、不規(guī)則形狀。鏡下可以觀察到體積較大，多個核的破骨樣細胞，體積較小呈圓形的細胞，多個突起的、不規(guī)則形態(tài)的樹突狀細胞。3～4周后細胞生長至80%～90%融合時按1：3進行消化傳代。傳代后的臍血間充質干細胞4～6h開始貼壁，增殖迅速，1周左右可達到80%～90%融合。三代以后細胞形態(tài)均勻，梭形的細胞呈漩渦狀或者火焰狀生長。

4.2 免疫表型的鑒定：目前認為MSCs表面抗原無特異性，既有間質細胞，又有內皮細胞及上皮細胞的特征。遲作華[17]總結了臍血間充質干細胞表達的主要分子包括：①粘附分子：CD54、CD51、CD44、CD13等；② 整合素家族成員：CD49b、CD49e、CD29等；③ 其他：CD90（Thy1）、SH2（CD105）、HLA-ABG、ASMA、SH13（CD166，ALCAM）、SH4（CD73）等。但不表達造血細胞表面標志，如：CD45、CD34、CD14、CD3、CD4、CD8、CD2、CD15、CD16、CD19、CD24、CD33、CD38、CD133、CD135（FH-3）、CD117（e-kit）、glycophorin A等也不表達與人白細胞抗原（HLA）識別有關的共刺激分子B7-1、B7-2及主要組織相容性復合物Ⅱ類分子，如HLA-DR等。

5面臨問題

臍血間充質干細胞分離成功率低，培養(yǎng)周期長，難以建立穩(wěn)定純化的細胞系從而實現(xiàn)體外的大量擴增[18]；個體差異較大，尚無統(tǒng)一的體外分離培養(yǎng)標準；缺乏特異的鑒定標記，目前主要通過細胞的形態(tài)和非特異表型進行鑒定；定向誘導分化的方法和機制，以及分化后功能能否發(fā)揮及如何保持有待深入研究；細胞因子對細胞增殖分化的作用及相互之間存在的影響；確定HLA配型不符的最低標準，以擴大供體的來源；移植治療的最佳時機、劑量。相信隨著對臍血間充質干細胞研究的深入，這些問題終將解決，使臍血間充質干細胞更廣泛地應用于基礎研究和臨床治療。

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[收稿日期]2012-05-04 [修回日期]2012-06-25

編輯/李陽利