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        考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定大豆莖葉中蛋白質(zhì)含量

        2012-04-29 10:55:01楊正坤王秀麗龍施華郝再彬單展展周菲菲
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年20期

        楊正坤 王秀麗 龍施華 郝再彬 單展展 周菲菲

        摘要:應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定大豆莖葉中蛋白質(zhì)含量。結(jié)果表明,該法測(cè)定大豆莖葉中蛋白質(zhì)含量是可行的,其RSD為0.25%~1.27%,回收率為94.9%~106.4%,大豆莖葉蛋白質(zhì)平均含量為7.673%和11.315%。該方法簡(jiǎn)便快速,靈敏度高、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確率相對(duì)較高,可用于微量可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

        關(guān)鍵詞:大豆莖葉;蛋白質(zhì)含量;考馬斯亮藍(lán)染色法

        中圖分類(lèi)號(hào):TS63文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(2012)20-4610-03

        蛋白質(zhì)是一項(xiàng)質(zhì)量和資源評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[1],用一種快速、準(zhǔn)確、方便的方法來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)含量是必不可少的。近年來(lái),許多學(xué)者用考馬斯亮藍(lán)染色法和其他方法對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了測(cè)定[2-9]。蛋白質(zhì)中的酰胺基團(tuán)與考馬斯亮藍(lán)染料中的陰離子結(jié)合使溶液顯藍(lán)色,測(cè)定效果可通過(guò)測(cè)定顯色穩(wěn)定性等多個(gè)性狀指標(biāo)進(jìn)行全面客觀地評(píng)價(jià)。本試驗(yàn)采用盆栽大豆,對(duì)大豆的莖葉蛋白質(zhì)含量與大豆產(chǎn)量進(jìn)行考察,通過(guò)分析它們之間的影響與關(guān)系,為今后大豆育種工作提供試驗(yàn)方法。

        1材料與方法

        1.1材料

        供試樣品為大豆莖葉(實(shí)驗(yàn)室自制)。

        牛血清白蛋白(進(jìn)口分裝),購(gòu)于上海億欣生物科技有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-250(進(jìn)口分裝),購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

        1.2儀器

        SHB-IIIS循環(huán)水式多用真空泵和抽濾裝置(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、EL303型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];Cary50紫外分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安有限公司)。

        1.3方法

        1.3.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取牛血清白蛋白100.0 mg,用去離子水定容至100 mL,即為

        1 mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液,4 ℃保存待用。

        1.3.2考馬斯亮藍(lán)G-250溶液的制備稱(chēng)取考馬斯亮藍(lán)G-250 100.0 mg于研缽中,取體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇(下同)50 mL,從中取約10 mL加入研缽,將考馬斯亮藍(lán)G-250研成粉并溶解;輕輕將上層液體轉(zhuǎn)入500 mL燒杯中,再取10 mL乙醇溶液于研缽中研磨,同法收集,重復(fù)洗滌3次。最后用20 mL乙醇分次洗滌研缽,合并液體于燒杯中。取體積分?jǐn)?shù)為85%濃磷酸100 mL分次加入燒杯再轉(zhuǎn)入

        1 L容量瓶,定容,抽濾,得考馬斯亮藍(lán)G-250溶液。

        1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取0.2~1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于10 mL試管中,各管補(bǔ)加0.15 mol/L NaCl溶液至1 mL,各取0.1 mL于新試管中并加入5 mL考馬斯亮藍(lán) G-250溶液,搖勻,放置 2 min,于595 nm 處測(cè)定其吸光度[7]。

        1.3.4樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定取樣品溶液0.1 mL,按上述方法測(cè)定其吸光度,再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品的蛋白質(zhì)含量[8]。

        2結(jié)果

        2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立

        用紫外分光光度計(jì),以0.15 mol/L的NaCl溶液作空白對(duì)照,在595 nm處測(cè)定對(duì)照品溶液吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),蛋白濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

        通過(guò)測(cè)定不同濃度牛血清白蛋白的吸光度得其線性回歸方程式:Y=0.478 3X+0.070 3,R2=0.999 3。

        2.2樣品蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

        按蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法,同時(shí)做3個(gè)重復(fù),大豆莖的吸光度為0.434 2、0.440 2和0.437 5 a.u.,大豆葉的吸光度為0.611 4、0.611 0和0.612 1 a.u.。計(jì)算大豆莖的蛋白質(zhì)含量為7.608%、7.734%和7.677%,平均含量為7.673%;大豆葉的蛋白質(zhì)含量為11.313%、11.305%和11.328%,平均含量為11.315%。

        2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

        量取同一樣品溶液 1 mL,每隔 10 min 測(cè)定1次,觀測(cè)其穩(wěn)定性,結(jié)果見(jiàn)表1,表明在顯色1 h 內(nèi)吸光度穩(wěn)定,RSD分別為0.04%和0.39%。

        2.4重復(fù)性試驗(yàn)

        按上述方法,分別測(cè)定大豆莖和葉蛋白提取液的吸光度,檢驗(yàn)該方法的重現(xiàn)性,結(jié)果見(jiàn)表2,RSD分別為0.83%和1.27%,小于5%,表明重現(xiàn)性較好。

        2.5精密度試驗(yàn)

        準(zhǔn)確吸取牛血清白蛋白溶液(1 mg/mL)0.5 mL進(jìn)行精密度試驗(yàn),連續(xù)測(cè)定其吸光度6次,其RSD為0.25%,小于5%,表明精密度較好,結(jié)果見(jiàn)表3。

        2.6回收率測(cè)定

        取已配制好的1 mg/mL牛血清白蛋白溶液0.1 mL,加入1 mL大豆莖(或葉)樣品溶液,然后再加入5 mL考馬斯亮藍(lán)染色液,搖勻,靜置2 min左右,于595 nm處測(cè)定其吸光度,以不加牛血清白蛋白溶液作為空白對(duì)照,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出相應(yīng)濃度,然后計(jì)算加入樣品蛋白的量,并計(jì)算回收率[9],結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明,該方法準(zhǔn)確度較高,可滿(mǎn)足大豆莖葉中蛋白含量的快速定量分析。

        3討論

        蛋白質(zhì)分子均具有酰胺基團(tuán),棕紅色的考馬斯亮藍(lán)G-250染料上的陰離子與蛋白質(zhì)的酰胺基團(tuán)結(jié)合,使溶液變?yōu)樗{(lán)色,由于溶液在595 nm處吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比,因此595 nm處測(cè)定吸光度,可計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)含量[6]。上述結(jié)果表明,考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)中的酰胺基團(tuán)結(jié)合生成的藍(lán)色非常穩(wěn)定,在1 h之內(nèi)吸光度值變化很小,重復(fù)性較好,精密度較高,同時(shí)該方法測(cè)定蛋白含量的回收率符合大豆莖葉蛋白質(zhì)含量的測(cè)定要求。大豆莖蛋白質(zhì)提取液中蛋白質(zhì)含量在0.7~1.0 mg/mL范圍內(nèi);大豆葉蛋白質(zhì)提取液中蛋白質(zhì)含量在1.1~2.0 mg/mL范圍內(nèi),用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定大豆莖葉蛋白質(zhì)的含量?jī)?yōu)于其他傳統(tǒng)方法[10,11]。但另一方面,該法線性范圍窄,低濃度樣品易受影響,因此,在測(cè)定時(shí)所用試管須經(jīng)酸浸泡,洗凈后應(yīng)經(jīng)高溫烘干。當(dāng)樣品濃度大于一定濃度時(shí),須稀釋測(cè)定,另外,可用乙醇和去離子水清洗比色皿上粘染的色素[12]。綜上所述,該法準(zhǔn)確率較高且簡(jiǎn)便靈敏,對(duì)設(shè)備要求低,受干擾小,適宜于測(cè)定大豆莖葉的蛋白質(zhì)含量。

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