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        IL—32在病理性瘢痕中的表達(dá)及其生物學(xué)作用研究

        2012-04-29 06:50:12李小川等
        中國美容醫(yī)學(xué) 2012年21期
        關(guān)鍵詞:疙瘩病理性瘢痕

        李小川等

        [摘要]目的:探討IL-32在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成過程中所起的生物學(xué)作用。方法:收集2009年10月至2011年6月廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院整形外科手術(shù)切除的瘢痕疙瘩組織12例,增生性瘢痕組織12例,正常皮膚24 例,分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)、RT-PCR和Western Blot檢測IL-32在它們中的表達(dá)情況。結(jié)果:IL-32在正常皮膚增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中均有表達(dá),在正常皮膚中表達(dá)較強(qiáng),在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中表達(dá)較弱;IL-32mRNA和IL-32蛋白在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表達(dá)較正常皮膚明顯降低(P均<0.05),而增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。結(jié)論:IL-32在病理性瘢痕組織的形成過程中起著一定的重要作用,有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

        [關(guān)鍵詞]IL-32;增生性瘢痕;瘢痕疙瘩

        [中圖分類號(hào)]R619+.6[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455(2012)11-1991-03

        病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩與增生性瘢痕,迄今尚無很好的治療方法,是整形外科臨床面臨的棘手問題之一。1992年Dahl等[1]發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞因子人白介素32 (interleukin-32, IL-32),2005年Kim SH等[2] 提出其有很多炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子的特性。近來研究證實(shí)其不但可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,而且在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡過程中有重要的作用[3],已經(jīng)成為腫瘤和結(jié)締組織疾病防治研究的重要對(duì)象[4]。病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩與增生性瘢痕,瘢痕疙瘩具有腫瘤樣生長的生物學(xué)特性,且被認(rèn)為是一種免疫性、炎癥性疾病[5]。IL-32基因是否在病理性瘢痕的發(fā)生發(fā)展過程中起作用,據(jù)筆者所查文獻(xiàn)目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過檢測IL-32在病理性瘢痕組織的表達(dá)來初步揭示IL-32 在病理性瘢痕形成中所起的生物學(xué)作用,進(jìn)而從另一角度認(rèn)識(shí)病理性瘢痕的發(fā)病機(jī)制,可能從分子水平上為瘢痕防治提供新的思路。

        1材料和方法

        1.1 材料:2009年10月至2011年6月收集廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院整形外科手術(shù)切除的瘢痕疙瘩組織標(biāo)本12例,其中男性5例,女性7例,年齡17~42歲,平均年齡29.5歲;增生性瘢痕組織標(biāo)本12例,其中男性4例,女性8例,年齡9~41歲,平均年齡25歲;正常皮膚標(biāo)本24 例,其中男性17例,女性7例。年齡10~45歲,平均年齡29歲。標(biāo)本取自先天性畸形、外傷、除皺術(shù)及包皮切除患者,取材部位為頭面、胸腹及四肢,瘢痕病變時(shí)間3~6個(gè)月。所有患者均無慢性疾病史,無長期服用藥物病史,瘢痕未行局部藥物注射治療,并知情同意。

        1.2 免疫組化檢測標(biāo)本中IL-32的表達(dá):常規(guī)制備石蠟切片,干燥保存?zhèn)溆?。按試劑盒說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié),SP)法,中性樹膠封片。每一批標(biāo)本均設(shè)已知陽性對(duì)照和用PBS替代一抗的空白對(duì)照,染色結(jié)果的判斷以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒為陽性染色。按盲法原則分別獨(dú)立對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。具體判斷標(biāo)準(zhǔn):采用專業(yè)圖像分析軟件IPP6.0對(duì)IL-32蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野(×400),測定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的累積光密度和所有細(xì)胞總面積,以每例5個(gè)視野的平均光密度作為該例的測量值,平均光密度=陽性反應(yīng)的累積光密度/細(xì)胞總面積。

        1.3 RT-PCR檢測IL-32mRNA表達(dá)

        1.3.1 主要試劑: Trizol 總RNA提取試劑盒、SuperScriptTMIII First-Strand synthesis system for RT-PCR和普通瓊脂糖(大連寶生物工程公司),Pfu DNA Polymerase(Tiangen公司),100bp DNA marker(Santa cruz公司),焦碳酸己二酯(DEPC)、二甲基亞砜(DMSO)、核糖核酸酶A(RNase A)、溴化乙錠(EB)(Sigma公司)。

        1.3.2RT- PCR測定

        1.4 Western Blot檢測IL-32蛋白的表達(dá):提取組織總蛋白后,用BCA蛋白定量試劑盒測濃度。將標(biāo)準(zhǔn)品按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl 加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中,加PBS補(bǔ)足到20μl,每一濃度做三個(gè)復(fù)孔。測定A562,計(jì)算各濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)的平均吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程。取上述蛋白樣品各20μg,進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blot檢測。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)一采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析,計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示;兩組間差異比較用t檢驗(yàn),三組間差異比較用方差分析和q檢驗(yàn)。P>0.05差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2結(jié)果

        2.1 免疫組化檢測結(jié)果:IL-32在正常皮膚、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中均有表達(dá)(圖1~3),其中在正常皮膚中表達(dá)較強(qiáng),在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中表達(dá)較弱,增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組IL-32蛋白的相對(duì)表達(dá)量與正常皮膚相比,其之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組的IL-32蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05)(表1),表明IL-32蛋白的表達(dá)與瘢痕的增生有關(guān)。

        2.2RT-PCR檢測結(jié)果:IL-32mRNA的擴(kuò)增曲線、熔解曲線(圖4),增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組IL-32 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別比正常皮膚組明顯降低(P均<0.05);增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組的相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2),表明病理性瘢痕中IL-32基因在mRNA水平與正常皮膚差異顯著。

        2.3Western Blot檢測結(jié)果:電泳結(jié)果(圖5、6),可見增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組IL-32蛋白表達(dá)較正常皮膚明顯減少。增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組IL-32蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別與正常皮膚相比,其之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組的IL-32蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3),說明病理性瘢痕中IL-32基因在蛋白表達(dá)水平與正常皮膚差異顯著。

        3討論

        目前研究發(fā)現(xiàn)IL-32的生物學(xué)功能如下:①誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[4];②是重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡的基因,如T細(xì)胞中IL-32的大量表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6];③在自身免疫性/炎癥性疾病里起重要的作用[7-10],如IL-32可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生且與多種炎癥性疾病密切相關(guān),是一種前炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子,它與疾病的嚴(yán)重性程度有關(guān),且在適應(yīng)性免疫應(yīng)答和固有性免疫應(yīng)答中都發(fā)揮作用。IL-32基因已被證實(shí)可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,其是否與增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的發(fā)生有關(guān),尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

        本實(shí)驗(yàn)RT-PCR結(jié)果表明IL-32基因在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中表達(dá)與正常皮膚相比均明顯減弱(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明IL-32基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)異常。由此推測,在病理性瘢痕的形成過程中可能存在著IL-32基因的缺失、突變或不表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致瘢痕異常增生,提示了IL-32基因在病理性瘢痕的形成過程中起著重要的作用。

        免疫組織化學(xué)研究結(jié)果表明: IL-32蛋白在正常皮膚組織中的表達(dá)最強(qiáng),而在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)均顯著低于正常皮膚中的表達(dá)。Western Blot檢測結(jié)果進(jìn)一步明確在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中IL-32蛋白表達(dá)量分別與正常皮膚相比明顯減少(P均<0.05),表明IL-32基因在蛋白翻譯水平同樣發(fā)生異常。由此推斷, IL-32蛋白在病理性瘢痕中的表達(dá)減少可能是由于IL-32mRNA的表達(dá)減少而引起或與相關(guān)上游的調(diào)控蛋白表達(dá)異常有關(guān)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示IL-32是病理性瘢痕發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵因素之一,值得進(jìn)一步深入研究。

        [參考文獻(xiàn)]

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        [收稿日期]2012-09-21 [修回日期]2011-11-03

        編輯/張惠娟

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