寧平　梁萍　向妮　鄭用璉　肖炎農(nóng)

摘要：以玉米絲軸黑粉菌（Sporisorium reilianum f.）為供試菌株，對(duì)其孢子原生質(zhì)體的制備和再生條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明，交配型菌株SR1加入5 mg/mL溶壁酶（Lysing Enzymes）、50 mg/mL崩潰酶（Driselase）與50 mg/mL蝸牛酶（Snailase）混合酶液，置于28 ℃ 100 r/ min搖床上酶解10 min，原生質(zhì)體得率為99.36%、產(chǎn)量1.35×108個(gè)/mL，以山梨醇為穩(wěn)滲劑，原生質(zhì)體涂布于含有1.0 mol/L山梨醇的CM再生培養(yǎng)基上，再生率可達(dá)35.63%。

關(guān)鍵詞：玉米絲軸黑粉菌；原生質(zhì)體；制備；再生

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.131.42文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114（2012）20-4520-04

玉米絲黑穗病是由玉米絲軸黑粉菌（Sporisorium reilianum f. ）引起的嚴(yán)重威脅玉米產(chǎn)量的病害。20世紀(jì)90年代前在中國(guó)發(fā)生較重，以后由于抗病品種的推廣有所減輕。近年來(lái)，由于新品種的引進(jìn)和抗性鑒定工作的滯后，玉米絲黑穗病又逐年加重，每年因玉米絲黑穗病危害減產(chǎn)達(dá)30萬(wàn)t[1]。玉米絲軸黑粉菌在玉米發(fā)芽期侵染，花期觀(guān)察到明顯癥狀，雌雄穗產(chǎn)生充滿(mǎn)孢子堆的病癭，表現(xiàn)為典型的苗期侵染、花期發(fā)病特點(diǎn)。一旦發(fā)病，往往整株都沒(méi)有收成。雖然該病在苗期也有些癥狀，如植株矮小、莖基膨大如筍狀、葉片簇生等，但是癥狀不明顯，且不容易與其他病毒病、生理病害、根部蟲(chóng)傷等所致癥狀相區(qū)分，因此難以在苗期發(fā)現(xiàn)病情，給該病的早期防治帶來(lái)一定難度。有學(xué)者研究苗期玉米絲黑穗病的檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)行了質(zhì)壁分離法PCR檢測(cè)技術(shù)鑒定[2]以及利用苗期檢測(cè)可溶性糖含量鑒定[3]等，這些方法有一定的局限性，難以應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。人們選育較好的抗性品種用于玉米絲黑穗病防治，研究者在玉米抗玉米絲黑穗病育種方面的研究較多，如抗性機(jī)理、抗性遺傳、抗病基因定位和抗病種質(zhì)資源[4]等。從分子水平研究玉米絲軸黑粉菌的致病機(jī)制，有助于從根本上控制該病的危害。目前對(duì)玉米絲黑穗病菌的遺傳轉(zhuǎn)化國(guó)內(nèi)外鮮有研究報(bào)道。試驗(yàn)通過(guò)制備該菌的原生質(zhì)體，發(fā)展出有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為研究玉米絲黑穗病菌的致病機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1原生質(zhì)體的制備和影響因素測(cè)定玉米絲軸黑粉菌菌種接入PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，取1/20接種量轉(zhuǎn)至新的PDA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，無(wú)菌水洗滌1次，加入酶液（表1）后，置搖床上28 ℃ 100 r/ min酶解。每隔 5 min取樣鏡檢觀(guān)察，待視野中絕大多數(shù)孢子釋放原生質(zhì)體時(shí)停止酶解，2 000 r/ min離心 6 min后用STC緩沖液洗滌3次，離心收集原生質(zhì)體。

1）不同酶及組合對(duì)原生質(zhì)體制備的影響。以不同濃度的溶壁酶、崩潰酶、蝸牛酶單獨(dú)處理或者混合處理玉米絲軸黑粉菌的擔(dān)孢子，比較單一酶和混合酶對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響。

2）不同滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體制備的影響。用CPB配制不同濃度的NaCl、MgCl2、KCl、D-sorbitol、蔗糖5種滲透壓穩(wěn)定劑，比較不同滲透壓穩(wěn)定劑及不同濃度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響，確定最佳滲透壓穩(wěn)定劑[6]。

3）菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備的影響。將活化3 d后的玉米絲軸黑粉菌菌液以1/20的接種量擴(kuò)大培養(yǎng)，收集不同時(shí)間段的擔(dān)孢子以5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩潰酶和50 mg/mL蝸牛酶3種酶混合酶解，比較菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備的影響。

4）酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備的影響。在酶解5、10、15、20、25 min時(shí)觀(guān)察原生質(zhì)體的形成及數(shù)量。

5）酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響。比較25、28、30、35、37 ℃ 5個(gè)酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響。

1.2.2不同酶組合及酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體再生的影響將不同酶濃度組合及不同酶解時(shí)間制備的原生質(zhì)體用平板稀釋法涂布于含有1.0 mol/L山梨醇的CM再生培養(yǎng)基上，5～7 d后觀(guān)察菌落數(shù)量并計(jì)算再生率。

2.1影響原生質(zhì)體制備的因素

2.1.1不同酶及其組合對(duì)原生質(zhì)體制備的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。酶的種類(lèi)對(duì)原生質(zhì)體釋放影響很大，當(dāng)用溶壁酶單獨(dú)處理玉米絲軸黑粉菌擔(dān)孢子時(shí)，原生質(zhì)體得率很低。即使延長(zhǎng)酶解時(shí)間至180 min，原生質(zhì)體得率也僅為5.33%。

兩種酶液混合處理的原生質(zhì)體得率雖然有所提高，但是提高不多，原生質(zhì)體得率為10%左右。用5 mg/mL溶壁酶、20 mg/mL崩潰酶和20 mg/mL蝸牛酶3種酶混合處理絲軸黑粉菌60 min時(shí)，原生質(zhì)體得率為57.06%，與單一酶和兩種酶處理相比顯著提高。5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩潰酶、50 mg/mL蝸牛酶3種酶的混合液為制備玉米絲軸黑粉菌原生質(zhì)體的最佳酶組合，酶解10 min原生質(zhì)體得率為99.36%。制備得到的原生質(zhì)體外觀(guān)見(jiàn)圖1。

2.1.2不同滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體制備的影響由于原生質(zhì)體對(duì)滲透壓敏感，合適濃度的穩(wěn)滲劑可以維持原生質(zhì)體的內(nèi)外滲透壓平衡。因此，穩(wěn)滲劑的種類(lèi)和濃度也非常關(guān)鍵。分別選用3種不同含量NaCl、MgCl2、KCl、山梨醇、蔗糖配制5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩潰酶、50 mg/mL蝸牛酶3種酶的混合液，觀(guān)察滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響。結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果表明，1.0 mol/L蔗糖作為穩(wěn)滲劑原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，1.0 mol/L山梨醇次之，為1.35×108個(gè)/mL。無(wú)機(jī)穩(wěn)滲劑效果較差，原生質(zhì)體之間容易融合成堆，說(shuō)明無(wú)機(jī)物不適合用作玉米絲軸黑粉菌原生質(zhì)體制備的穩(wěn)滲劑。從原生質(zhì)體產(chǎn)量和聚集情況綜合考慮，確定以1.0 mol/L山梨醇作為穩(wěn)滲劑制備玉米絲軸黑粉菌原生質(zhì)體。

2.1.3菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備的影響細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)在細(xì)胞的不同生長(zhǎng)時(shí)期有所不同，導(dǎo)致細(xì)胞壁對(duì)溶壁物質(zhì)敏感性的差異。將活化培養(yǎng)3 d后的菌液以1/20的接種量擴(kuò)大培養(yǎng)，收集不同時(shí)間段的擔(dān)孢子，以5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩潰酶、50 mg/mL蝸牛酶3種酶混合液酶解，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可見(jiàn)，24 h為玉米絲軸黑粉菌擴(kuò)大培養(yǎng)最佳菌齡時(shí)間，此時(shí)細(xì)胞壁最敏感，制備原生質(zhì)體得率最高。此后隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)原生質(zhì)體得率降低。

2.1.4酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備的影響酶解時(shí)間也是影響原生質(zhì)體得率的重要因素之一，在酶解5、10、15、20、25 min時(shí)測(cè)定原生質(zhì)體的得率，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，酶解10 min時(shí)，原生質(zhì)體的得率最高，達(dá)99.36%。此前隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體的得率增加；此后隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體的得率有所下降。

2.1.5酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備的影響酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體得率的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，28 ℃為酶解的最適溫度，超過(guò)或低于28 ℃原生質(zhì)體得率明顯下降。

2.2原生質(zhì)體的再生情況

酶的組合和酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體再生有一定的影響（表5）。酶濃度低，需要的處理時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)使先形成的原生質(zhì)體破裂，造成再生率低。

3小結(jié)與討論

試驗(yàn)研究了玉米絲軸黑粉菌孢子原生質(zhì)體的制備和再生條件，結(jié)果表明，菌株SR1活化3 d后以1/20的接種量繼續(xù)培養(yǎng)24 h，離心收集的菌體加入5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩潰酶、50 mg/mL蝸牛酶混合酶液，置于28 ℃ 100 r/ min搖床上酶解10 min，原生質(zhì)體得率為99.36%，以山梨醇為穩(wěn)滲劑產(chǎn)量可達(dá)1.35×108個(gè)/mL，再生率為35.63%。

玉米絲軸黑粉菌為擔(dān)子菌亞門(mén)病原真菌，其擔(dān)孢子細(xì)胞壁主要成分是幾丁質(zhì)（幾丁聚糖）和葡聚糖，用單一酶如蝸牛酶、溶壁酶、崩潰酶，都不能完全降解細(xì)胞壁以產(chǎn)生足夠的原生質(zhì)體[5-8]。蝸牛酶雖然是復(fù)合酶，可能是由于所含酶的種類(lèi)關(guān)系，更適合于降解含有較多葡聚糖的真菌。崩潰酶作為另外一類(lèi)復(fù)合酶，在多種植物病原真菌的原生質(zhì)體制備中得到應(yīng)用[9]，但單獨(dú)使用對(duì)玉米絲軸黑粉菌孢子酶解作用也較差，溶壁酶單獨(dú)使用效果也不理想。這說(shuō)明玉米絲軸黑粉菌孢子的細(xì)胞壁成分比較特殊，很難用一種通用酶去除。試驗(yàn)中，2種以上酶混合作用于玉米絲軸黑粉菌孢子可獲得較高的原生質(zhì)體得率，用5 mg/mL溶壁酶、50 mg/mL崩潰酶和50 mg/mL蝸牛酶混合作用可使孢子在短時(shí)間內(nèi)完全溶壁。制備真菌的原生質(zhì)體時(shí)濃度適宜的混合酶較單一酶更好，這個(gè)結(jié)論與前人的研究結(jié)果一致[10，11]。在酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的影響試驗(yàn)中，鏡檢可觀(guān)察到原生質(zhì)體在酶液中隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少，后續(xù)試驗(yàn)中再生率也有所降低，可見(jiàn)酶對(duì)原生質(zhì)膜有一定破壞作用。酶濃度提高時(shí)，所含其他雜酶也相應(yīng)提高，更容易破壞原生質(zhì)體并影響其活性。

試驗(yàn)中有機(jī)化合物作為穩(wěn)滲劑效果要比無(wú)機(jī)化合物好，這與前人報(bào)道一致[8]。無(wú)機(jī)化合物作為穩(wěn)滲劑容易使原生質(zhì)體發(fā)生聚集，這種情況可能會(huì)影響到后續(xù)的再生和轉(zhuǎn)化。

菌體能否產(chǎn)生大量活性高的原生質(zhì)體與菌體本身的生理狀態(tài)有一定的關(guān)系。酶的作用受菌齡的影響，菌齡過(guò)大菌體的細(xì)胞壁老化增厚，酶解難度增加，原生質(zhì)體釋放難度較大；通過(guò)大幅增加酶解時(shí)間菌體更容易釋放原生質(zhì)體，但是原生質(zhì)體容易破裂且不容易再生，所以掌握菌齡對(duì)于制備原生質(zhì)體非常重要。在酶濃度與酶解時(shí)間這兩個(gè)因素當(dāng)中，酶解時(shí)間對(duì)再生的影響較大。隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，原生質(zhì)體再生能力下降。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王振華，姜艷喜，王立豐，等.玉米絲黑穗病的研究進(jìn)展[J].玉米科學(xué)，2002，10（4）：61-64.

[2] 倪深，肖炎農(nóng)，王鳳格，等.基于PCR技術(shù)的玉米絲軸黑粉菌侵染率及擴(kuò)展進(jìn)程的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（9）：1804-1809.

[3] 王振華，劉長(zhǎng)華，張林，等. 玉米絲黑穗病苗期快速鑒定方法[J].植物保護(hù)，2009，35（6）：99-103.

[4] 李莉，賈立輝，樸紅梅，等. 玉米抗絲黑穗病的研究進(jìn)展[J]. 玉米科學(xué)，2008，16（6）：136-138.

[5] 王杰，林俊芳，云慧，等. 草菇原生質(zhì)體制備、再生及轉(zhuǎn)化研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（3）：119-121.

[6] 李芳蓮，閆曉星.綠粘帚霉原生質(zhì)體制備和再生條件的研究[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，26（2）：149-153.

[7] 詹萍，蘇龍，周乃東.紅酵母原生質(zhì)體制備和再生條件研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（3）：1154-1155，1172.

[8] 薛偉，趙筱萌，劉素花，等.桃褐腐病菌（Monilia fructigena）原生質(zhì)體制備及再生條件[J].微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（1）：71-77.

[9] THON M R， NUCKLES E M， VAILLANCOURT L J. Restriction enzyme mediated integration used to produce pathogenicity mutants of Colletot richum Graminicola [J]. Mol Plant Microbe Interact，2000，13（12）：1356-1365.

[10] GALLMETZER M， BURGSTALLER W， SCHINNER F. An optimized method for the isolation of protoplasts from Penicillium simplicissimum to produce sealed plasma membrane vesicles[J]. Mycologia，1999，91（1）：206-212.

[11] LI W J， ZHENG Y X， WANG H Z， et al. Protoplast formation and regeneration of gibberellin-producing strains of Gibberella fujikuroi[J]. Acta Mycol Sin，1992，11（3）：221-228.