孫 偉，白 劍，李鳳巖，苗 健，苗蘭英

(1.朝陽市第二醫(yī)院胃腸外科，遼寧 朝陽 122000；2.遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽 110847；3.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，大連 116021)

大腸癌是一種高發(fā)的消化道腫瘤，臨床上的治療方案以手術切除配合放化療為主，如病情嚴重則以主張通過化療提高患者的生活質量，延長生存期[1]。甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)屬五環(huán)三萜類化合物，其藥理學活性廣泛，包括抗炎、抗病毒、抗腫瘤和抑制細菌生長等[2]。有研究顯示GA在體外可以有效的抑制甲狀腺癌細胞的增殖，其機制與抑制AKT/NF-κB信號通路活性有關[3]。核轉錄因子κB(nuclear factor Kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)的異常表達與多種疾病如大腸癌的發(fā)生密切相關。炎癥細胞釋放的趨化因子和細胞因子可以上調NF-κB在炎癥組織中的表達，而NF-κB的上調可以增加腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視的能力[4]。在小鼠的腸癌模型中也發(fā)現(xiàn)降低腸上皮中的NF-kB表達可以明顯抑制消化道腫瘤的生長[5]。因此，本研究通過觀察GA在體外對大腸癌LoVo細胞的增殖和侵襲的影響，分析其可能作用途徑，為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘草次酸購買于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司(產品標號：S0988,HPLC≥98%)；四氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、TRIzol和5氟尿嘧啶(5 fluorouracil,5-FU) (產品標號：F6627-5G,HPLC≥99%)購買于西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；大腸癌LoVo細胞株購買于上海碧云天生物技術有限公司(產品標號：C6519)；DMEM/F-12培養(yǎng)基和胎牛血清購自GBICO公司；Transwell(型號3422)小室培養(yǎng)板購買于美國康寧公司；Annexin V/PI AAD細胞凋亡檢測試劑盒買于美國BD公司；α-Tubulin(產品編號：sc-8035)和NF-kB p-P65(產品編號：sc-8008)抗體購買于Santa Cruz公司；分析純試劑購買于國藥集團北京分公司；；FACSCalibur流式細胞儀購買于美國BD公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購買于美國Thermo公司；550酶標儀和垂直系列電泳儀購買于美國伯樂公司。

1.2 大腸癌LoVo細胞培養(yǎng)和分組[3,6]

將大腸癌LoVo細胞接種在含10%胎牛血清的DMEM/F-12中培養(yǎng)，當細胞融合度達到90%后，將細胞用0.5%胰酶消化后，接種于6孔板和96孔板內。在細胞融合度達到70%后將細胞分為對照組，GA低、中、高劑量組和5-FU組，每組設置6個復孔。其中對照組為不含有血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基，GA低、中、高劑量組中GA的濃度分別為50,100,200 μmol/L，5-FU組為濃度100 μmol/L的5-FU。在分組后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后進行相關的檢測。

1.3 大腸癌LoVo細胞增殖的檢測

將接種于96孔板的細胞用PBS沖洗2次后，加入MTT溶液孵育30 min，用移液器移除液體后，在每孔中加入100 μl的二甲基亞砜，在振蕩儀上搖勻10 min。酶標儀在光波長570 nm 處檢測光密度值。細胞增殖率( %) = 干預組光密度值) /對照組光密度值× 100%。

1.4 大腸癌LoVo細胞凋亡的檢測

將經過分組并藥物孵育的大腸癌LoVo細胞從96孔板消化后分別收集到離心管內，用PBS沖洗后在1 100 r/min下離心3 min，重復上述沖洗過程一次。將經過洗滌后的細胞收集到離心管中，在避光條件下按照Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作，并通過流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。

1.5 大腸癌LoVo細胞的侵襲能力的檢測

將接種于六孔板的大腸癌LoVo細胞消化后用DMEM/F-12重懸細胞，將細胞濃度調整為5×105cells/ml，在每個Transwell小室中加入0.2 ml的細胞混懸液，之后在每孔中加入1 ml不含血清的對照組，GA低、中、高劑量組和5-FU組的培養(yǎng)基，每組設置6個復孔，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。帶培養(yǎng)完畢后，在每孔中加入0.5 ml結晶紫溶液孵育30 min對細胞染色，在顯微鏡下計數(shù)。

1.6 大腸癌LoVo細胞中蛋白質NF-κB的檢測

將在6孔板內培養(yǎng)48 h各組大腸癌LoVo細胞用PBS清洗后，加入Trizol裂解，將裂解后的液體收集到1.5 ml EP管中，煮沸5 min使蛋白質變性，在 12 000 r/min低溫離心機中離心1 min。使用BCA法對蛋白定量，向SDS-PAGE凝膠中加各組蛋白樣品，轉PVDF 膜。使用5%脫脂奶粉封閉樣品后，加入稀釋后的一抗NF-κB p-P65 (1∶1 000)和α-Tubulin (1∶1 000)，4℃孵育過夜后，加入二抗在37℃孵育1 h，DAB顯色。通過條帶的灰度值確定蛋白質的表達水平。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 GA對大腸LoVo細胞增值的影響

經過GA和5-FU 孵育12 h后，與對照組相比，5-FU組中的細胞增殖率顯著低于對照組(P<0.05)；經過GA和5-FU 孵育24 h和48 h后，與對照組相比，GA的中、高劑量組和5-FU組中的細胞增殖率均顯著低于對照組(P<0.05，表1)

Tab. 1 Effects of different concentrations ofglycyrrhetinic acid on the ratio of proliferation in colorectal cancer LoVo (%， n=6)

2.2 GA對大腸LoVo細胞凋亡的影響

各組細胞經過GA和5-FU孵育48 h后，與對照組相比，GA中、高劑量組和5-FU組的G0/G1期細胞比例明顯高于對照組 (P<0.05)；與對照組相比，GA低、中、高劑量組和5-FU組的G2/M期細胞比例明顯低于對照組的細胞 (P<0.05，表2)

Tab. 2 Effects of different concentrations of glycyrrhetinic acid on the ratio of apoptosis in Colorectal cancer LoVo after 48 hours of incubation (%， n=6)

2.3 GA對大腸LoVo細胞侵襲能力的影響

各組細胞經過GA和5-FU孵育48 h后，與對照組相比，GA低、中、高劑量組和5-FU組的細胞計數(shù)明顯低于對照組(P<0.05)。

2.4 GA大腸LoVo細胞中蛋白質NF-κB增殖的影響

各組細胞經過GA和5-FU孵育48 h后，濃度為100 μmol/L和200 μmol/L GA組中NF-κB蛋白表達的相對量為分別為(2.28±0.46)和(1.91±0.11)，與對照組(3.31±0.45)相比有顯著性差異(P<0.05)，且NF-κB的表達隨著GA濃度增加而逐漸減弱，呈現(xiàn)劑量依賴性(圖1)。

Fig. 1 Expression of NF-κB proteins after colorectal cancer LoVo cells were incubated with different concentrations of glycyrrhetinic acid for 48 h

3 討論

NF-κB中一類關鍵性的核轉錄因子，通常以同源或異源二聚體非活性形式存在于幾乎所有類型細胞的胞質中，NF-κB核轉錄因子參與炎癥、腫瘤、細胞生長和免疫反應等多種疾病的發(fā)展過程，而大腸癌的轉移和復發(fā)與NF-κB的表達密切相關[4]。有研究報道，NF-κB可以幫助大腸癌逃避機體的免疫監(jiān)視，造成腫瘤的遠處轉移，如果抑制NF-κB的表達可以誘導大腸癌細胞凋亡[7，8]。許多凋亡相關的調節(jié)蛋白如p53、TRAIL、Caspase、Survivin、COX-2等均受到NF-κB信號通路的調控[9]。因此，如果能有效的抑制NF-κB的表達，就可以促進腫瘤細胞進入凋亡途徑，并最終減少腫瘤復發(fā)和轉移。

大腸癌在中醫(yī)術語“腸覃”和“積聚”的范疇，腸覃乃寒氣客于大腸，濕毒瘀滯，積聚與腹，宜選用益氣固本、清熱解毒的治療方法[10]。甘草是傳統(tǒng)中草藥，具有補脾益氣、解毒緩急的功效。GA作為甘草水解后的有效成分之一具有明確抗腫瘤作用，對GA體外治療敏感的腫瘤包括胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、胰腺癌、食管癌和部分血液腫瘤[11，12]。本室前期的研究發(fā)現(xiàn)[3]，GA在體外濃度達到100 μmol/L就可有效的抑制甲狀腺癌細胞的增殖，抑制效果隨著藥物作用的時間和濃度的增加呈現(xiàn)一定的時間和劑量依賴性。因此，本次實驗在選取濃度為100 μmol/L的GA作為中濃度并進一步觀察藥物-劑量的關系。通過大腸癌LoVo細胞凋亡的檢測發(fā)現(xiàn)低濃度的GA能夠明顯增加G0/G1期的細胞數(shù)量，G2/M期的數(shù)量顯著降低，提示GA可以把大腸癌細胞阻滯在G0/G1期。有研究顯示cyclin D1蛋白作為細胞周期調節(jié)蛋白在G1期起重要調節(jié)作用，其在大腸癌組織中均有不同程度的過度表達，而在對不同類型腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，GA可以通過抑制cyclin D1的表達實現(xiàn)對大腸癌細胞增殖的抑制作用[13,14]。由此可見，GA對大腸癌細胞增殖的抑制作用和細胞周期的影響可能與GA通過抑制cyclin D1的表達有關。有研究顯示GA可以通過PI3K-Akt-mTOR通路和NF-κB通路抑制胃癌細胞SGC7901 增殖[11]，通過抑制NF-κB的表達降低腫瘤的轉移和侵襲能力。在本次實驗中GA可以抑制大腸癌細胞中NF-κB的表達，隨著GA濃度逐漸升高，NF-κB蛋白的表達逐漸減弱，二者呈現(xiàn)劑量依賴性關系[4]。

綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)濃度為100 μmol/L 的GA能抑制大腸癌細胞增殖，其機制可能與抑制NF-κB信號通路有關，對于臨床的治療效果尚有待觀察。