李進波　查中萍　萬丙良　戚華雄

摘要：根據(jù)ＲＮＡｉ表達載體的設(shè)計原則，以ＴＷＨ基因為靶基因，將長度２５３ｂｐ目的片段通過正反兩個方向插入表達載體ｐＲ１３０１中，構(gòu)建ＲＮＡｉ表達載體ｐＲ１３０１－ＴＷＨ。通過根癌農(nóng)桿菌ＥＨＡ１０５介導(dǎo)法將其導(dǎo)入水稻品種武育粳３號，獲得３４株陽性轉(zhuǎn)基因植株，為進一步深入研究ＴＷＨ基因功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻（OryzasativaL.）；ＴＷＨ基因；ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）；載體構(gòu)建；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號：Ｓ５１１；Ｑ７８１ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）24－5791-03

ＲＮＡ干涉（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是指內(nèi)源性或外源性雙鏈ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ）介導(dǎo)的同源ｍＲＮＡ發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達沉默從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型的缺失現(xiàn)象，屬于轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象。ＲＮＡｉ是在研究秀麗新小桿線蟲中被首次發(fā)現(xiàn)［１］，利用這一技術(shù)可以有效、特異性降解靶標基因ｍＲＮＡ，阻止靶標基因的表達，從而研究目標基因的功能。

目前，水稻中已有許多利用ＲＮＡｉ技術(shù)進行基因功能分析或驗證的報道［２－４］。從水稻育種后代材料中發(fā)現(xiàn)一個水稻穎殼扭曲突變體，該突變體主要表現(xiàn)為穎殼扭曲變形，子粒充實不飽滿［５］。進一步的研究結(jié)果表明，該突變體穎殼扭曲性狀受一對隱性基因控制，其對應(yīng)的ＴＷＨ基因被精細定位在第二染色體的ＳＳＲ標記ＲＭＬ２５和ＲＭＬ３５之間，兩個ＳＳＲ標記間的物理距離為１１．９ｋｂ，并確定了其候選基因。該研究通過構(gòu)建水稻ＴＷＨ基因的ＲＮＡｉ表達載體，利用根癌農(nóng)桿菌ＥＨＡ１０５介導(dǎo)法將其導(dǎo)入水稻品種武育粳３號中，獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株，為ＴＷＨ基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

１ 材料與方法

１．１ 試劑

１．２ 載體及菌株

１．３ 植物材料和遺傳轉(zhuǎn)化方法

供試水稻材料為武育粳３號成熟種子誘導(dǎo)初生愈傷組織，作為與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的受體材料。水稻的組織培養(yǎng)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻以及抗性愈傷組織的篩選與植株再生等參照劉巧泉等［６］建立的高效轉(zhuǎn)化方法進行。

１．４ ＰＣＲ引物設(shè)計及目的片段擴增

１．５ 目的片段的克隆

將目的片段切下，通過膠回收試劑盒回收ＰＣＲ產(chǎn)物并純化后連接到ｐＭＤ１８－Ｔ載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ＤＨ５α感受態(tài)細胞，涂布在含１００ｍｇ／Ｌ氨芐青霉素的Ｘ－Ｇａｌ／ＩＰＴＧ的ＬＢ固體培養(yǎng)基上，３７℃培養(yǎng)過夜，挑取白色單菌落于含１００ｍｇ／Ｌ氨芐青霉素的ＬＢ液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，通過菌落ＰＣＲ篩選陽性克隆，獲得重組載體ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＷＨ，將陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

１．６ ＲＮＡｉ表達載體的構(gòu)建

１．７ 轉(zhuǎn)基因植株的ＰＣＲ檢測

２ 結(jié)果與分析

２．１ ＲＮＡｉ表達載體構(gòu)建

２．２ 水稻遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的獲得

以武育粳３號成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌ＥＨＡ１０５介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將表達載體ｐＲ１３０１－ＴＷＨ導(dǎo)入水稻中。經(jīng)潮霉素抗性篩選，選擇生長旺盛的抗性愈傷組織進行分化再生培養(yǎng)，最終獲得４０株T0代轉(zhuǎn)基因植株。以轉(zhuǎn)基因植株葉片總ＤＮＡ為模板，用潮霉素基因特異引物Ｐ７與Ｐ８進行ＰＣＲ檢測（圖５），共有３４株檢測到５１７ｂｐ左右的目標片段，ＰＣＲ陽性率為８５％。

３ 小結(jié)與討論

１）雖然ＲＮＡ干涉在作用機制等方面還不十分清楚，但作為一種新的技術(shù)方法，已經(jīng)在各個不同的生物研究中被廣泛應(yīng)用。應(yīng)用ＲＮＡ干涉技術(shù)迅速地抑制目的基因的表達，能盡快了解到目的基因的功能。該研究將構(gòu)建的表達載體ｐＲ１３０１－ＴＷＨ導(dǎo)入水稻愈傷組織中，獲得了陽性轉(zhuǎn)基因植株，下一步計劃將轉(zhuǎn)基因苗移栽到海南試驗基地，抽穗后進行表型鑒定和表達分析，研究ＴＷＨ基因的功能。

２）載體設(shè)計是載體構(gòu)建的關(guān)鍵。由于ＲＮＡｉ機制只對成熟的ｍＲＮＡ產(chǎn)生作用，因此用于設(shè)計ＲＮＡ干涉載體的靶序列應(yīng)處于基因的一個外顯子內(nèi)。Ｗｅｓｌｅｙ等［７］的研究表明ＲＮＡｉ片段的長度在９８～８５３ｎｔ之間都是可行的，不會對沉默效率產(chǎn)生明顯影響；同時將間隔區(qū)內(nèi)含子插入反向互補重復(fù)區(qū)可以增強其穩(wěn)定性。因此，在本研究中我們選擇ＴＷＨ基因一個外顯子部分的２５３ｂｐ為靶序列構(gòu)建ＲＮＡｉ載體，并在兩個反向重復(fù)序列間加入一個Ｗａｘｙ基因的內(nèi)含子作為間隔區(qū)，目的是為了提高轉(zhuǎn)基因后代的沉默效率，有效抑制目的基因的表達。

參考文獻：

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［６］劉巧泉，張景六．根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立［Ｊ］．植物生理學(xué)報，１９９８，２４（３）：２５９－２７１．

［７］ＷＥＳＬＥＹＳＶ，ＨＥＬＬＩＷＥＬＬＣＡ，ＳＭＩＴＨＮＡ，ｅｔａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｄｅｓｉｇｎｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｎｄｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２００１，２７（６）：５８１－５９０．