來雷　楊林軍　翟昌林

[摘要] 目的 探討高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）siRNA干擾后對乳腺癌細(xì)胞MCF—7增殖的影響。 方法 構(gòu)建靶向HMGB1 mRNA的質(zhì)粒載體pRI—GFP—1、pRI—GFP—2以及陰性對照載體pRI—GFP—Neg，分別轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF—7，48 h、72 h后免疫印跡法（Western blot）檢測HMGB1基因蛋白表達(dá)，噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測體外增殖活性。 結(jié)果 轉(zhuǎn)染后，與空質(zhì)粒組pRI—GFP—Neg相比，pRI—GFP—1組、pRI—GFP—2組MCF—7細(xì)胞HMGB1蛋白表達(dá)下降，MTT顯示干擾組細(xì)胞增殖速率與質(zhì)粒對照及空白對照組相比顯著降低。 結(jié)論 應(yīng)用RNAi技術(shù)可以顯著干擾HMGB1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而有效抑制MCF—7細(xì)胞的增殖活性。

[關(guān)鍵詞] 高遷移率族蛋白1；RNA干擾；MCF—7細(xì)胞

[中圖分類號] R737.9[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A[文章編號] 1673—9701（2012）24—0023—03

Effects of HMGB1 silence by RNA interference on the cell proliferation in MCF—7 cells

LAI Lei1 YANG Linjun2 ZHAI Changlin1

1.Department of Oncology，the First People''s Hospital of Tongxiang City in Zhejiang Province，Tongxiang 314500，China；2.Department of Oncology，Changhai Hospital of Shanghai，Shanghai 200433，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of HMGB1 RNA interference on MCF—7 cell proliferation. Methods The plasmid construct pRI—GFP—1， pRI—GFP—2 targeted HMGB1 mRNA and negative control construct pRI—GFP—Neg， were transfected into MCF—7 cells. After 48 h， 72 h， using real—time quantitative PCR to detect HMGB1 gene mRNA expression， WB to detect HMGB1 protein expression；the cell proliferating activity in vitro was examined by MTT analysis. Results After transfection， compared with the pRI—GFP—Neg group， the inhibition rates of HMGB1 expression in MCF—7 cells in pRI—GFP—1 group， pRI—GFP—2 group were decreased. The cell proliferation rate was significantly lower in pRI—GFP—1 group than in pRI—GFP—Neg group （P < 0.05）. Conclusion Application of RNAi technology can significantly interfere the HMGB1 gene expression， thus inhibit MCF—7 cell proliferation.

[Key words] HMGB1； Small interfering RNA； MCF—7 cell

高遷移率族蛋白1（HMGB1）在多種腫瘤中高表達(dá)，其水平遠(yuǎn)高于相對應(yīng)的正常組織，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、病灶大小、浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。其機(jī)制可能與HMGB1本身作為一種細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)小血管再生以及可以調(diào)控其他一些基因的表達(dá)相關(guān)。有研究表明HMGB1在乳腺癌組織中的表達(dá)與腫瘤臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，但是缺乏細(xì)胞學(xué)研究的報(bào)道。本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了HMGB1基因siRNA真核表達(dá)載體，觀察其對人乳腺癌MCF—7 HMGB1基因表達(dá)及細(xì)胞生長等生物學(xué)功能的影響，旨在進(jìn)一步闡明HMGB1在乳腺癌中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒

HMGB1 pRI—GFP質(zhì)粒及陰性、陽性對照質(zhì)粒由Inovogen公司構(gòu)建，人乳腺癌MCF—7細(xì)胞株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科醫(yī)院中心試驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑

鼠抗人HMGB1單克隆抗體（德國R&D公司），鼠抗人β—actin多克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（H+L）（Pierce Biotechnology， Rock—ford，IL），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin 2000（Invitrogen 公司），實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒（大連寶生物公司）、RMPI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、無血清無抗生素RMPI 1640培養(yǎng)液。引物由上海生工公司合成。

1.3 MCF—7細(xì)胞HMGB1

siRNA 轉(zhuǎn)染MCF—7細(xì)胞用含10%小牛血清和抗生素的RMPI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長。實(shí)驗(yàn)設(shè)四組，實(shí)驗(yàn)組pRI—GFP—1、pRI—GFP—2 組、pRI—GFP—Neg（陰性對照）組及空白對照（MCF—7未轉(zhuǎn)染）組。細(xì)胞3×105/孔分別接種6 孔板至細(xì)胞長滿85%～90%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作按照試劑說明進(jìn)行。

1.4 Western blot檢測HMGB1蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，定量后取總蛋白40 μg，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉，加HMGB1 單克隆抗體（稀釋度1∶500）辣根過氧化酶標(biāo)記二抗（Pierce Biotechnology，美國）化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng)，X光片曝光顯影，經(jīng)ABB成像分析系統(tǒng)掃描（ABI公司，美國），以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β—actin灰度值的比值反映HMGB1的表達(dá)水平。

1.5 MTT檢測細(xì)胞增殖

選擇干擾效率較高的pRI—GFP—1組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染0 h、48 h、72 h后，以每孔1 000個(gè)分別接種各組細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同時(shí)設(shè)立空白對照組，培養(yǎng)24 h后，每孔加20 μL的MTT溶液，37℃，5%CO2飽和濕度下孵育4 h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加二甲基亞嵐（DMSO）150 μL，酶標(biāo)儀檢測每孔吸光度值（A）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P < 0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WB檢測各組中HMGB1蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h、72 h pRI—GFP—1組、pRI—GFP—2組HMGB1蛋白水平較pRI—GFP—Neg組及空白對照組明顯減低（P < 0.05）， 且pRI—GFP—1組干擾效率優(yōu)于pRI—GFP—2組；pRI—GFP —Neg組與空白對照組各時(shí)間點(diǎn)蛋白表達(dá)差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞的增殖

轉(zhuǎn)染后48 h、72 h、96 h、120 h pRI—GFP—1組較pRI—GFP—Neg及細(xì)胞對照組生長明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），轉(zhuǎn)染后96 h細(xì)胞生長抑制率達(dá)到最高。

3 討論

HMGB1是與染色體結(jié)合的非組蛋白成分之一。該蛋白基因定位于人染色體13q12 帶，共含有5 個(gè)外顯子，相對分子質(zhì)量為25 000，由215 個(gè)氨基酸組成，屬于HMG 蛋白超家族。HMGB1與DNA結(jié)合，可穩(wěn)定核小體形狀，作為基因和組織特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性的作用。近來的研究表明，多種腫瘤和未成熟細(xì)胞均可以產(chǎn)生高遷移率族蛋白HMGB1，與癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

楊曉文等研究表明，HMGB1在乳腺癌組織中的表達(dá)與腫瘤臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，但在細(xì)胞學(xué)的研究未見報(bào)道。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)驗(yàn)證了HMGB1在乳腺癌細(xì)胞系中是高表達(dá)的，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了含有U6啟動子的HMGB1 siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染入乳腺癌細(xì)胞系MCF—7中，RT—PCR及WB驗(yàn)證針對兩個(gè)不同靶位點(diǎn)的兩條siRNA干擾效率均達(dá)到60%，但是pRI—GFP—1的干擾效率要高于pRI—GFP—2，因此我們在生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)中選擇pRI—GFP—1干擾質(zhì)粒。研究結(jié)果表明，RNA干擾下調(diào)HMGB1基因后，MCF—7細(xì)胞增殖受到明顯抑制，細(xì)胞生長曲線低平，缺乏指數(shù)增長特征。

HMGB1的生物學(xué)活性主要通過與其相應(yīng)受體的相互作用而實(shí)現(xiàn)，其中RAGE是HMGB1的主要受體，通過與HMGB1高親和力結(jié)合，通過激活p38 MAPK，p44/p42 MAPK，SAPK/JNK等信號通路促進(jìn)細(xì)胞生長[6]。有研究顯示HMGB1可以抑制p53抑癌活性，阻止細(xì)胞對損傷DNA的修復(fù)，過度活化Ras/ERK信號傳導(dǎo)通路等，抑制HMGB1的表達(dá)可能通過以上受體依賴型途徑減慢了細(xì)胞生長。HMGB1靶向siRNA抑制細(xì)胞增殖的具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步證實(shí)。

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（收稿日期：2012—04—01）