楊永勤,孫沫逸,李建虎,梁亮,申志遠(yuǎn)

[摘要]目的：探討不同濃度普萘洛爾在不同時間段內(nèi)對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用。方法：收集手術(shù)切除的新鮮嬰幼兒血管瘤標(biāo)本，采用組織塊法培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，免疫熒光法對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定；通過繪制生長曲線和流式細(xì)胞儀檢測普萘洛爾(propranolol) 對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響。結(jié)果：伴隨普諾洛爾濃度增大(0μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，120μg/ml)及作用時間的增加（24h,48h,72h）對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)；流式細(xì)胞儀測定不同濃度普萘洛爾作用不同時段后 血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡明顯。結(jié)論：普萘洛爾能抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，抑制血管瘤的生長。

[關(guān)鍵詞]普萘洛爾；血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞；凋亡

[中圖分類號]R732.2[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）04-0602-03

Effects of propranolol on proliferation of hemangioma endothelial cells from infantile

YANG Yong-qin,SUN Mo-yi,LI Jian-hu,LIANG Liang,SHEN Zhi-yuan

(Department of Oral and Maxillofacial Surgery,School of Stomatology,The Fourth Militiary Medical University,Xi＇an 710032,Shanxi,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the Effects of propranolol on proliferation of hemangioma endothelial cells from infantile.MethodsIn this study,we treated the vascular endothelial cells of hemangioma in 96-well plates with different dose(0μg/ml to 120μg/ml)of propranolol.the survival and proliferatoin of the vascular endothelial cells of hemangioma were evaluated by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetra-zoloum(MTT) assay and crystal violet assay. The effects of propranolol on the vascular endothelial cells of hemangioma were observed by cell growth curves and flow cytometry.ResultsWith the augmentation of the concentration of propranolol (0μg/ml,20μg/ml, 40μg/ml, 60μg/ml,80μg/ml,100μg/ml, 120μg/ml)and the lengthening of action time（24h,48h,72h）,proliferation of hemangioma endothelial cells are inhibiting apparently.AnnexinV-PI assay were aslo performed.propranolol could inhibit the growth of vascular endothelial cells of hemangioma and advancing apoptosis. Conclusion Propranolol is able to inhibit the proliferation of the hemangioma endothelial cells , and to advance apoptosis of vascular endothelial cells,resulting in inhibition of hemangioma.

Key words:Propranolol; hemangioma endothelial cells；apoptosis

針對血管瘤，目前臨床常用的藥物主要有糖皮質(zhì)激素、干擾素α、環(huán)磷酰胺、長春新堿等，然而，這些藥物均有其不同程度的不良反應(yīng)，因此在臨床使用中受到不同程度的限制。自2008年，法國Bordeaux兒童醫(yī)院Léauté-Labrèze等醫(yī)生在美國《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》報道了他們應(yīng)用普萘洛爾（propranolol）治療嬰兒血管瘤的重大發(fā)現(xiàn)。報道用β受體阻斷劑-普萘洛爾（propranolol）成功治療小兒血管瘤患者后，因普萘洛爾耐受性良好，相比類固醇有較少的副作用，或?qū)⒊蔀樗幬镏委熝芰龅男逻x擇。本實(shí)驗(yàn)采用組織塊法培養(yǎng)出血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，并將不同濃度普萘洛爾添加到傳代后的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。探討普萘洛爾是否對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞有抑制作用，進(jìn)而證明其對血管瘤是否有治療作用。

1材料和方法

1.1 標(biāo)本來源：第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院手術(shù)切除的血管瘤標(biāo)本。

1.2 主要試劑和儀器：DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)基（Hyclone）、胰蛋白酶（Amresco）、青霉素+鏈霉素、胎牛血清(胎牛血清)，D'hanks（武漢谷歌生物），鼠抗人Ⅷ因子、MTT （北京索萊寶）、DMSO（北京索萊寶）、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（凱基生物），96孔培養(yǎng)板（Corning）、CO2恒溫培養(yǎng)箱（SANYO）、FAC-SCalibur型流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司)、計算機(jī)數(shù)據(jù)處理軟件(BD公司Cellquest軟件)。

1.3 血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞分離和培養(yǎng)：①標(biāo)本， 4℃無菌D～Hank液試管中保存；②用D-Hank液及PBS液沖洗標(biāo)本至肉眼觀察沖洗液顏色清亮，無渾濁及脫落組織；③去除多余的皮膚及脂肪，選擇瘤體組織，適當(dāng)修剪成1～2cm3的組織塊， 0.25%胰蛋白酶中37℃振蕩消化10～20 min，加入含1O%胎牛血清(fetalbovine serum，F(xiàn)BS)培養(yǎng)液中止消化；④將消化后的組織微粒，接種于事備好的培養(yǎng)皿內(nèi)，靜置10 min；然后加入約0.5ml完全內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(成分DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)基、20% 胎牛血清、1O IU L青霉素、100 mg／I 鏈霉素)，僅使培養(yǎng)液剛剛濕潤組織塊，勿使組織塊浮起，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育；⑤24 h后補(bǔ)充培養(yǎng)基，使培養(yǎng)液緩慢浸潤組織塊，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；5 天后更換培養(yǎng)液；⑥接種后1周去除組織塊，倒置相差顯微鏡下確認(rèn)內(nèi)皮細(xì)胞島，用細(xì)胞刮去除非內(nèi)皮細(xì)胞，更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，每3天更換培養(yǎng)液1次；⑦細(xì)胞匯合成片鋪滿培養(yǎng)皿時按1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.4 血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察：倒置相差顯微鏡下觀察血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長情況和形態(tài)學(xué)特征，并用數(shù)碼照相機(jī)記錄觀察的結(jié)果（圖1）。

1.4.2 免疫熒光法鑒定：將血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片， PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS沖洗，0.3%的過氧化氫室溫下封閉10 min，然后用正常血清室溫下封閉10 min，分別加入第Ⅷ 因子相關(guān)抗原鼠抗人抗體(工作濃度l∶200) 4℃過夜，PBS沖洗后在暗室條件下加入鼠抗兔二抗熒光顯色液，熒光顯微鏡下觀察拍照（圖2）。

1.5 MTT對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞毒性的測定

1.5.1 MTT檢測細(xì)胞抑制率：①將對數(shù)生長期細(xì)胞用胰蛋白酶消化后配制成濃度為1～10×104個/ml的細(xì)胞懸液，經(jīng)過細(xì)胞技術(shù)按10000細(xì)胞/孔接種于96孔板，每孔加200μl；②將平板置37℃、5%CO2濕度培養(yǎng)箱中24h后，于24h、48h、72h分別加入各個細(xì)胞樣品對應(yīng)的含有一定濃度藥物（0μg/ml,20μg/ml,40μg/ml,60μg/ml,80μg/ml,100μg/ml, 120μg/ml）的培養(yǎng)基，每個樣本濃度設(shè)平行的三個孔，對照組加不含樣本的培養(yǎng)液200μl，再放入培養(yǎng)箱中孵育；③于倒置顯微鏡下拍照，拍攝200×的細(xì)胞狀態(tài)；④每孔加入用按5mg/ml新鮮配制的MTT溶液50μl，溫育4h，使MTT還原為甲瓚，當(dāng)在倒置顯微鏡下看到孔板內(nèi)的細(xì)胞周圍出現(xiàn)絲狀紫色結(jié)晶體時倒掉上清液，每孔加DMSO（二甲基亞砜）200μl，用平板搖床搖勻后，使用酶標(biāo)儀測定光密度值（OD）（檢測波長570nm），以溶劑對照處理細(xì)胞為對照組，按公式計算普萘洛爾對細(xì)胞的抑制率。

1.5.2 改良寇式法計算IC50：

改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg 最大劑量，I:lg(最大劑量/相臨劑量)，P:陽性反應(yīng)率之和，Pm:最大陽性反應(yīng)率，Pn:最小陽性反應(yīng)率

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡：①接種細(xì)胞至六孔板，吸除培養(yǎng)液，用PBS或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入1ml胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓，部分細(xì)胞懸浮，即加入PBS終止消化；②用移液槍輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞懸浮.離心1 500轉(zhuǎn)5min，棄上清；③加入3ml PBS，用漩渦震蕩儀是細(xì)胞充分懸浮于PBS中，離心1 500轉(zhuǎn)5min，棄上清；④加入300μl的裂解緩沖液（Binding Buffer）懸浮細(xì)胞；⑤Annexin V-FITC，Propidium Iodide （PI）使用前瞬時離心集液；⑥加入5μl Annexin V-FITC混勻后，加入5μl Propidium Iodide，混勻；⑦室溫、避光、反應(yīng)5～15min.8.在1 hour內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測.用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm；發(fā)射波長Em=530 nm。Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測；PI紅色熒光通過PI通道（FL2）檢測。

1.7 統(tǒng)計結(jié)果χ2檢驗(yàn)：不同濃度(0μg/ml,20μg/ml, 40μg/ml,60μg/ml,80μg/ml,100μg/ml,120μg/ml)作用后血管內(nèi)皮細(xì)胞作用不同時間（24h,48h,72h）后抑制率。統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用spss17.0統(tǒng)計軟件包對細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行分析。采用總體方差分法,P<0.05,差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義,可以認(rèn)為隨普萘洛爾濃度的增大及作用時間的延長，普萘洛爾對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)。

2結(jié)果

2.1 組織塊結(jié)合酶消化法培養(yǎng)初學(xué)管理血管內(nèi)皮細(xì)胞并對細(xì)胞進(jìn)行純化（如圖1），擴(kuò)增及采用免疫熒光法檢測（如圖2）。

2.2 MTT法檢測培養(yǎng)于含有不同濃度（0μg/ml,20μg/ml, 40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，120μg/ml）普萘洛爾培養(yǎng)基中作用不同時間（24h、48h、72h）后血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的存活率。經(jīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞伴隨普奈落濃度的增大及作用時間的延長，血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)（如圖3）。

2.3改良寇氏法測定普萘洛爾作用血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞后的IC50為100μg/ml。

2.4流式細(xì)胞儀檢測不同濃度普萘洛爾作用血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示普萘洛爾可明顯促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡（如圖4a、b、c）。

3討論

3.1 普萘洛爾抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用及其意義：2008年在Bordeaux兒童病院Léauté-Labrèze等醫(yī)生用普萘洛爾治療一位伴有嚴(yán)重的鼻部血管瘤的阻塞性、肥厚性心肌病的患兒時發(fā)現(xiàn)，患者面部的血管瘤逐漸減小，停用后仍然減小，最后血管瘤幾近完全消失[1]。隨后眾多醫(yī)生開始嘗試在臨床使用普萘洛爾治療血管瘤，試圖將其作為一種新的治療血管瘤的藥物。根據(jù)文獻(xiàn)報道單獨(dú)使用普萘洛爾治療血管瘤得到一定的療效，并未發(fā)現(xiàn)明顯的并發(fā)癥[2-3]，但是，沒有說明其對血管瘤的明確作用機(jī)制，同時也沒有一個統(tǒng)一給藥劑量標(biāo)準(zhǔn)，處于臨床嘗試階段。血管內(nèi)皮細(xì)胞現(xiàn)已被公認(rèn)為血管瘤增殖期占主要細(xì)胞成分。本實(shí)驗(yàn)取手術(shù)切除的血管瘤組織采用組織塊法培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞并對其進(jìn)行鑒定[4]，并將不同濃度普萘洛爾添加于血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，探討普萘洛爾對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增值影響，并試圖篩選出普萘洛爾作用于血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的最適濃度，為該藥的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3.2 血管瘤是嬰幼兒期常見的腫瘤，40%～60%發(fā)生于頭頸部。近年來，許多作者對血管瘤的病變過程進(jìn)行了相關(guān)研究，同時對實(shí)施了具體治療的病例和只進(jìn)行了保守觀察的病例之間預(yù)后的差別行了比較，并制定了一定的治療方案。體積較小、病變處于穩(wěn)定期、消退期和消退完成期的血管瘤適于隨訪觀察，增生期血管瘤需按照循序漸進(jìn)的原則進(jìn)行積極治療。手術(shù)治療不再作為早期血管瘤的首選，而是用于血管瘤后期殘存病變的切除或修整。有些作者主張使KTP、Nd：YAG激光治療等方法，更多主張使用閃光燈脈沖染料激光，但是組織內(nèi)激光照射治療會產(chǎn)生瘢痕，并且會對深部解剖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損害，所以使用前應(yīng)考慮到其安全性.綜合先前各種治療方法[5-9]，都有其明顯的缺點(diǎn)，目前臨床對表淺的血管瘤主張局部藥物注射治療，創(chuàng)傷小，不會產(chǎn)生明顯的瘢痕，本實(shí)驗(yàn)旨在探索普萘洛爾對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用并通過將血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于含有不同濃度普萘洛爾的培養(yǎng)基中，通過對其作用不同時間段進(jìn)行檢測，統(tǒng)計分析表明其對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞有明顯抑制作用，并通過改良寇氏公式計算出普萘洛爾作用血管內(nèi)皮細(xì)胞的IC50為100μg/ml，這為臨床用藥治療血管瘤提供了更準(zhǔn)確的治療依據(jù)，為該藥的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。也為臨床采用普萘洛爾治療血管瘤提供了更準(zhǔn)確的依據(jù)，同時增加了藥物治療血管瘤的選擇。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀檢測到普萘洛爾可以促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。這表明普萘洛爾可通過凋亡途徑抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，可能為普萘洛爾治療血管瘤的機(jī)制之一。

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[收稿日期]2011-12-22[修回日期]2012-02-28

編輯/張惠娟